高考生物 专题八 现代生物科技专题二轮复习

高考生物 专题八 现代生物科技专题二轮复习

专题八　现代生物科技专题 直击考纲1.基因工程的诞生(Ⅰ)。2.基因工程的原理及技术(Ⅱ)。3.基因工程的应用(Ⅱ)。‎ ‎4.植物的组织培养(Ⅱ)。5.动物的细胞培养与体细胞克隆(Ⅰ)。6.细胞融合与单克隆抗体(Ⅱ)。7.动物胚胎发育的基本过程与胚胎工程的理论基础(Ⅰ)。8.胚胎干细胞的移植(Ⅰ)。9.胚胎工程的应用(Ⅱ)。‎ ‎1．判断下列有关基因工程的叙述 ‎(1)生长激素基因在转录时需要解旋酶和DNA连接酶 (2012·四川，2D)(　×　)‎ ‎(2)一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列 (经典高考题)(　√　)‎ ‎(3)每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点 (2011·浙江，6B)(　√　)‎ ‎(4)应用DNA探针技术可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达 ‎(2011·四川，5D)(　×　)‎ ‎(5)用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸 (2010·浙江，‎2A)(　×　)‎ ‎(6)自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上，属于基因工程 (2010·大纲全国Ⅱ，5D)(　×　)‎ ‎(7)转抗虫基因的植物，不会导致昆虫群体抗性基因频率增加 (2010·江苏，18B)(　×　)‎ ‎(8)限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶 (2009·浙江，3B)(　√　)‎ ‎2．判断下列有关细胞工程的叙述 ‎(1)培养基中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压 (2008·江苏，‎20A)(　√　)‎ ‎(2)去除植物细胞的细胞壁和将动物组织分散成单个细胞均需酶处理 ‎(2008·全国Ⅰ，5B)(　√　)‎ ‎(3)不同种植物原生质体融合的过程属于植物体细胞杂交过程(2009·全国Ⅰ，4B)(　√　)‎ ‎(4)利用植物体细胞杂交技术可克服生殖隔离的限制，培育远缘杂种 ‎(2009·全国Ⅰ，‎4A)(　√　)‎ ‎(5)培养保留接触抑制的细胞在培养瓶壁上可形成多层细胞 (2010·浙江，‎4A)(　×　)‎ ‎(6)克隆培养法培养过程中多数细胞的基因型会发生改变 (2010·浙江，4B)(　×　)‎ ‎(7)二倍体细胞的传代培养次数通常是无限的 (2010·浙江，‎4C)(　×　)‎ ‎(8)恶性细胞系的细胞可进行传代培养 (2010·浙江，4D)(　√　)‎ ‎3．判断下列有关胚胎工程及其应用的叙述 ‎(1)绝大多数精卵细胞的识别具有物种特异性 (2012·浙江，‎2A)(　√　)‎ ‎(2)卵裂期胚胎中细胞数目和有机物总量在不断增加 (2009·江苏，‎8A)(　×　)‎ ‎(3)早期胚胎培养与动物细胞培养的培养液通常都需加入血清 (2011·江苏，‎18C)(　√　)‎ ‎(4)受精卵发育到原肠胚阶段才能进行胚胎移植 (2011·江苏，18B)(　×　)‎ ‎(5)试管婴儿技术主要包括体外受精、早期胚胎培养和胚胎移植技术 ‎(2011·江苏，18D)(　√　)‎ ‎(6)胚胎分割时需将原肠胚的内细胞团均等分割 (2009·江苏，8B)(　×　)‎ ‎(7)利用胚胎分割技术可以获得两个基因型完全相同的胚胎 (2010·江苏，‎16C)(　√　)‎ ‎(8)胚胎干细胞具有细胞核大、核仁小和蛋白质合成旺盛等特点(2009·江苏，‎8C)(　×　)‎ 重点一　基因工程 ‎1．完善如下基因工程的主干知识图解 ‎(1)目的基因的获取 ‎(2)基因表达载体的构建(目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因)‎ (3)将目的基因导入受体细胞 导入植物：农杆菌转化法、基因枪法、　　 花粉管通道法 导入动物：显微注射法导入微生物：感受态细胞法(用Ca2＋处理 ‎(4) 目的基因的检测与鉴定 插入检测：DNA分子杂交,转录检测：DNA—RNA分子杂交 翻译检测：抗原—抗体杂交)),个体水平检测——抗性接种实验 ‎2．基本工具 限制酶 DNA连接酶 载体 作用 切割目的基因和载体 拼接DNA片段，形成重组DNA 携带目的基因进入受体细胞 作用 部位 两个核苷酸的脱氧核糖与磷酸间形成的磷酸二酯键 作用 特点 ‎(条件)‎ 识别特定的核苷酸序列；‎ 在特定位点上切割 E·coliDNA连接酶只能连接黏性末端；‎ T4DNA连接酶能连接黏性末端和平末端 能在宿主细胞内稳定存在并大量复制；‎ 有多个限制酶切割位点；‎ 具有特殊的标记基因 ‎3.基因表达载体的构建过程 技能点拨 ‎1．区分DNA连接酶和DNA聚合酶、限制性核酸内切酶和解旋酶 ‎(1)DNA连接酶连接两个DNA片段，而DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上。‎ ‎(2)限制性核酸内切酶是切割某种特定的脱氧核苷酸序列，并使两条链在特定的位置断开，而解旋酶是将DNA的两条链间的氢键打开形成两条单链。‎ ‎2．启动子和终止子 启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，启动转录；终止子是终止转录的位点。插入的目的基因只是结构基因部分，其表达需要调控序列，因而用作载体的质粒的插入部位前需要有启动子，后需要有终止子。‎ ‎3．区分一个至多个限制酶切点与每种酶一个切点 ‎(1)一个至多个限制酶切点：作为载体必须具有一个至多个限制酶切点，以便与外源基因连接。‎ ‎(2)每种酶一个切点：每种酶的切点最好只有一个。因为某种限制酶只能识别单一切点，若载体上有一个以上的酶切点，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则进入受体细胞后便不能自主复制。一个载体若只有某种限制酶的一个切点，则酶切后既能把环打开接纳外源DNA片段，又不会丢失自己的片段。‎ ‎4．根据受体种类确定基因工程的受体细胞 受体种类不同，所用的受体细胞种类也不相同。‎ ‎(1)植物：由于植物细胞具有全能性，植物体细胞经过植物组织培养能够形成植物体，所以植物的受体细胞一般是体细胞。‎ ‎(2)动物：由于动物细胞没有全能性，不能由一个体细胞培养成一个个体，所以动物基因工程的受体细胞不是体细胞，而是受精卵。‎ ‎(3)微生物：多用原核生物细胞，因为原核生物繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少。‎ 对位训练 ‎1．某质粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程如图所示，请回答下列问题。‎ ‎(1)将抗盐基因导入烟草细胞内，使烟草植株产生抗盐性状，这种新性状(变异性状)的来源属于________________。‎ ‎(2)如果将抗盐基因直接导入烟草细胞，一般情况下，烟草不会具有抗盐特性，原因是抗盐基因在烟草细胞中不能____，也不能__________________________。‎ ‎(3)在构建重组质粒时，应选用________和________两种酶对________________和________进行切割，以保证重组DNA序列的唯一性。‎ ‎(4)基因工程中的检测筛选是一个重要的步骤。为筛选出导入了重组质粒的农杆菌，下图表示运用影印培养法(使一系列培养皿的相同位置上能出现相同菌落的一种接种培养方法)检测基因表达载体是否导入了农杆菌。‎ 培养基除了含有细菌生长繁殖必需的成分外，培养基A和培养基B分别还含有____________、________。从检测筛选的结果分析，含有目的基因的是________________菌落中的细菌。为了确定抗盐烟草是否培育成功，既要用放射性同位素标记的________________作探针进行分子杂交检测，又要用______________________________________方法从个体水平鉴定烟草植株的耐盐性。‎ ‎(5)将转入抗盐基因的烟草细胞培育成完整的植株需要用________________技术，愈伤组织经__________________进而形成完整植株，此过程除营养物质外还必须向培养基中添加____________________。‎ 答案　(1)基因重组　(2)复制　表达(合成抗盐基因的mRNA)　(3)Sal Ⅰ　Hind Ⅲ　抗盐基因的DNA　质粒 ‎(4)氨苄青霉素　四环素(氨苄青霉素和四环素)　4和6　抗盐基因　一定浓度的盐水浇灌烟草植株(将烟草植株移栽到盐碱地中)　(5)植物组织培养　细胞增殖和分化　植物激素(生长素和细胞分裂素) ‎ 解析　(1)基因工程利用的原理是基因重组，题中烟草植物产生的抗盐性状的来源是基因重组。(2)若把抗盐基因直接导入烟草细胞中，抗盐基因易被烟草细胞内的酶破坏，而不能进一步复制、转录、翻译成相关的蛋白质。(3)根据题图中三种酶作用的部位，可确定在构建重组质粒时，应选用Sal Ⅰ和Hind Ⅲ酶对质粒和抗盐基因的DNA进行切割。(4)检测基因表达载体是否导入了农杆菌，依据基因表达载体中的抗性基因的作用配制培养基；从检测筛选的结果分析，培养基B中没有4和6菌落，再结合构建基因表达载体时，目的基因插入的位置，可推测4和6菌落的细胞中质粒被插入了目的基因，四环素抗性基因被破坏，这样的农杆菌不能在其上生长繁殖；为了确定抗盐烟草是否培育成功，可进行分子检测和个体检测。(5)将“细胞”培养成“完整个体”需采用植物组织培养技术；愈伤组织经细胞增殖和分化，在生长素和细胞分裂素的调节下可培育成完整个体。‎ ‎2．浙江大学农学院喻景权教授课题组研究发现，一种植物激素——油菜素内酯能促进农药在植物体内的降解和代谢。用油菜素内酯处理后，许多参与农药降解的基因(如P450基因和红霉素抗性基因)的表达和酶活性都得到提高，在这些基因“指导”下合成的蛋白酶能把农药逐渐转化为水溶性物质或低毒甚至无毒物质，有的则被直接排出体外。某课题组进一步进行了如下的实验操作，请回答下列问题：‎ ‎(1)获得油菜素内酯合成酶基因的方法有____________________________________。步骤①用PCR技术扩增基因时用到的耐高温酶通常是指______________________________；步骤②用到的酶有 ‎________________________________________________________________________。‎ ‎(2)图中导入重组质粒的方法是____________，在导入之前应用一定浓度的__________________处理受体细菌。‎ ‎(3)导入重组质粒2以后，往往还需要进行检测和筛选，可用__________________制成探针，检测是否导入了重组基因，在培养基中加入__________可将含有目的基因的细胞筛选出来。‎ ‎(4)请你为该课题命名：‎ ‎________________________________________________________________________。‎ 答案　(1)从cDNA文库中获取、从基因组文库中获取、人工合成目的基因或PCR扩增(任选其中两项即可)　TaqDNA聚合酶　限制酶和DNA连接酶　(2)转化法　氯化钙溶液　(3)红霉素抗性基因　红霉素　(4)探究油菜素内酯能否促进土壤中农药的分解 解析　进行基因工程操作时，首先要获取目的基因，其方法有多种：从cDNA文库中获取、从基因组文库中获取、人工合成目的基因或PCR扩增等。在构建基因表达载体的过程中，用到的工具酶有限制酶和DNA连接酶。图中的受体细胞是细菌，故用转化法导入基因表达载体，导入后，需检验和筛选。从图中可以看出，最终是通过对照实验来检验转基因细菌对土壤中残留农药的分解能力。‎ 重点二　克隆技术 ‎1．植物体细胞杂交与单克隆抗体制备过程比较 步骤 植物体细胞杂交过程 单克隆抗体制备过程 第一步 原生质体的制备(酶解法)‎ 正常小鼠免疫处理 第二步 原生质体融合(物、化法)‎ 动物细胞融合(物、化、生物法) ‎ 第三步 杂种植株的筛选与培养 杂交瘤细胞筛选与培养 第四步 杂种植株的诱导与鉴定 单克隆抗体的提纯 深度思考　(1)诱导融合的方法分别有哪些？融合的细胞类型有哪几种？‎ 提示　①诱导植物体细胞的原生质体融合的方法主要有离心、振动、电激或用聚乙二醇作为诱导剂。②动物细胞融合常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒(诱导动物细胞融合的特有因素)、电激等。‎ 融合的细胞类型：前者—AA、BB、AB。后者—瘤瘤、B瘤、BB。‎ ‎(2)各自的原理分别有哪些？‎ 提示　前者有细胞膜的流动性和植物细胞的全能性，后者有细胞膜的流动性和细胞增殖。‎ ‎2．植物组织培养和动物细胞培养的比较 ‎3.完善如下克隆动物培育流程图 深度思考　D个体的性别和性状和哪个个体相同？‎ 提示　根据发育成新个体D的重组细胞核由动物B提供，而性别及大多数遗传性状是由核内遗传物质决定的，故B、D两者的性别及大多数遗传性状相同。‎ 技能点拨 ‎1．容易混淆的三种细胞——杂种细胞、重组细胞和杂交细胞 ‎(1)杂种细胞：植物体细胞杂交过程中，两种细胞去掉细胞壁之后形成的原生质体融合，融合的原生质体出现细胞壁之后形成的细胞叫杂种细胞。‎ ‎(2)重组细胞：体细胞的细胞核移植到去核卵母细胞之后形成的细胞叫重组细胞。‎ ‎(3)杂交细胞：动物细胞融合形成的细胞常称为杂交细胞。‎ ‎2．克隆动物与试管动物认识的误区 ‎(1)误区一：试管动物与克隆动物的产生都是无性生殖。‎ 纠正：试管动物的产生是有性生殖，克隆动物的产生是无性生殖。‎ ‎(2)误区二：试管动物(哺乳类)的产生是在体外进行的，克隆动物(哺乳类)的产生是在体内进行的。‎ 纠正：试管动物(哺乳类)和克隆动物(哺乳类)早期胚胎之前都是在体外进行的，早期胚胎经过胚胎移植之后是在体内进行的。‎ ‎(3)误区三：胚胎移植的优势是充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力，因此胚胎移植的胚胎只能来自体内受精的胚胎。‎ 纠正：胚胎移植的胚胎有三个来源：体内正常受精产生的胚胎、核移植产生的重组细胞培养而来的胚胎、体外受精产生的早期胚胎。‎ 对位训练 ‎3．如图为某二倍体植株花药中未成熟花粉在适宜培养基上形成完整植株的过程。下列有关叙述正确的是 (　　)‎ A．过程①②表示脱分化，过程③表示再分化 ‎ B．过程①②需要避光，过程③需要照光 C．过程①②③说明花粉细胞具有全能性 D．过程③获得的完整植株自交后代不会发生性状分离 答案　C 解析　图中过程①②③分别表示脱分化、再分化、发育过程。过程①不需光照，过程②③需要适宜光照。将花粉细胞培育成完整植株，体现了细胞的全能性。花药离体培养获得的为单倍体植株，高度不育。‎ ‎4．(2013·海南卷，31)单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV－1)可引起水泡性口唇炎。利用杂交瘤技术制备出抗HSV－1的单克隆抗体可快速检测HSV－1。‎ 回答下列问题：‎ ‎(1)在制备抗HSV－1的单克隆抗体的过程中，先给小鼠注射一种纯化的HSV－1蛋白，一段时间后，若小鼠血清中抗________________的抗体检测呈阳性，说明小鼠体内产生了________________反应，再从小鼠的____________中获取B淋巴细胞。将该B淋巴细胞与小鼠的________________细胞融合，再经过筛选、检测，最终可获得所需的杂交瘤细胞，该细胞具有的特点是 ‎________________________________________________________________________。‎ ‎(2)若要大量制备抗该蛋白的单克隆抗体，可将该杂交瘤细胞注射到小鼠的____________中使其增殖，再从__________中提取、纯化获得。‎ ‎(3)通过上述方法得到的单克隆抗体可准确地识别这种HSV－1蛋白，其原因是该抗体具有________和__________等特性。‎ 答案　(1)HSV—1蛋白　体液免疫　脾脏　骨髓瘤　无限增殖且产生专一性抗体　(2)腹腔　腹水　(3)纯度高　特异性强 解析　 (1)单克隆抗体制备的第一步是获得免疫动物。先给小鼠注射一种纯化的HSV－1蛋白，这就得到了免疫小鼠。一段时间后，若小鼠血清中抗HSV－1蛋白的抗体检测呈阳性，说明小鼠体内产生了体液免疫反应，小鼠体内已经有了该抗体，而抗体就是通过体液免疫产生的。第二步是制备杂交瘤细胞。从小鼠的淋巴器官中(如脾、骨髓、扁桃体、胸腺等)获取B淋巴细胞，与小鼠的骨髓瘤细胞融合，再经过筛选检测，最终可获得所需的杂交瘤细胞(只产生抗HSV－1蛋白抗体的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合细胞)，杂交瘤细胞具有两个亲本细胞的特性(既能无限增殖，又能产生专一性抗体)。(2)要想获得大量单克隆抗体，通常有两种方法：一是将杂交瘤细胞培养在动物细胞培养液中，然后从动物细胞培养液中分离出单克隆抗体；二是将杂交瘤细胞注射到小鼠的腹腔中使其增殖，然后从小鼠的腹水中提取纯化获得。(3)单克隆抗体具有：特异性强，灵敏度高的特点(特异性强：因为它只针对一种蛋白质如HSV－1蛋白；灵敏度高：因为抗体的纯度高，浓度高，能迅速和抗原结合，发生抗原—抗体反应)。‎ 重点三　胚胎工程 ‎1．完善下面的早期胚胎发育过程 受精卵 卵裂 桑椹胚：卵裂形成的包括32个细胞左右的胚，每个细胞都属于全能细胞 ‎　 幼体 ‎2．胚胎工程操作流程分析(以牛为例)‎ 深度思考　(1)上述图示中几次用到了激素？分别是什么作用？‎ 提示　两次；第一次用激素对受体和供体母牛进行同期发情处理；第二次用促性腺激素对供体做超数排卵处理。‎ ‎(2)胚胎移植过程进行哪两次检查？‎ 提示　第一次是对收集的胚胎进行检查；第二次是对受体母畜是否妊娠进行检查。‎ ‎(3)胚胎移植所用胚胎是有性生殖还是无性生殖产生的？‎ 提示　是有性生殖还是无性生殖，取决于胚胎是由受精卵形成，还是通过核移植技术形成重组细胞发育而成或胚胎分割形成。其中通过核移植技术和胚胎分割形成的胚胎是无性生殖产生的。‎ ‎(4)胚胎移植(胚胎能够移入受体、胚胎收集、胚胎在受体能够存活、胚胎能够正常生长发育)的几个生理学基础是什么？‎ 提示　①哺乳动物排卵后，同种供受体生殖器官的生理变化是相同的，这是胚胎能够移入受体的生理基础。‎ ‎②早期胚胎形成后，未与母体子宫建立联系，而是处于游离状态，这是胚胎收集的生理基础。‎ ‎③受体对移入子宫的外来胚胎基本不发生免疫排斥反应，这是胚胎在受体内能够存活的生理基础。‎ ‎④供体胚胎可与受体子宫建立联系，且不影响供体胚胎的遗传特性，这是供体胚胎正常发育的生理基础。‎ ‎3．胚胎干细胞的培养流程 对位训练 ‎5．牛胚胎移植的基本程序如图，请据图回答：‎ ‎(1)图中a、b、c过程分别是指____________、____________、____________。‎ ‎(2)在胚胎移植过程中，供、受体母牛选择好后，要用动物激素进行同期发情处理，这样处理的原因是________________________________________，以保证移植的胚胎能够继续正常发育。‎ ‎(3)为了提高牛胚胎的利用率，常采取的方法是________________；处理的时期是________________。‎ ‎(4)从哺乳动物早期胚胎或原始性腺中分离出来的细胞，称为ES或EK细胞。这类细胞的形态特征有________________________________________________________________________‎ ‎____________。‎ ‎(5)下图是利用胚胎工程技术培育优质奶牛的主要步骤。下列叙述正确的是(　　)‎ A．胚胎移植可以定向改造动物遗传性状，③需移植到发情的母牛子宫内发育 B．A细胞不一定是受精卵细胞 C．①②两个胚胎具有不同遗传物质 D．图中a过程包括卵裂、囊胚和原肠胚等阶段 答案　(1)超数排卵处理　胚胎的收集　胚胎移植　(2)使供、受体母牛处于相同的生理状态　(3)胚胎分割移植　囊胚期或桑椹胚期　(4)体积小，细胞核大，核仁明显　(5)B 解析　(1)图示a、b、c过程依次为对供体母牛进行超数排卵处理、配种后胚胎的收集和向受体母牛的胚胎移植。(2)为使受体接受胚胎应对供受体进行同期发情处理。(3)为提高胚胎利用率宜采取胚胎分割移植技术。(4)胚胎干细胞的形态特征包括体积小、核大、核仁明显等。(5)胚胎移植不能定向改造动物的遗传性状；①和②两个胚胎是由同一胚胎分割而来的，其遗传物质相同；在胚胎分割移植时，胚胎未发育到原肠胚阶段；A细胞也可以为核移植的重组细胞。‎ ‎6．(2013·江苏卷，13)软骨发育不全为常染色体显性遗传病，基因型为HH的个体早期死亡。一对夫妻均为该病患者，希望通过胚胎工程技术辅助生育一个健康的孩子。下列做法错误的是 (　　)‎ A．首先经超数排卵处理后进行体外受精 B．从囊胚中分离细胞，培养后检测基因型 C．根据检测结果筛选基因型为hh的胚胎 D．将胚胎培养至原肠胚期后移植到子宫 答案　D 解析　胚胎移植的时期是桑椹胚或囊胚，D错误。‎ 网络小结 ‎　　　　　　　　　　　　　　　　　　　‎ ‎1．转基因生物可用于生产人类所需要的药用蛋白，如激素、抗体、疫苗、酶等。下图甲是通过生物工程培育能产生人胰岛素的烟草的过程。请据图回答下列问题：‎ ‎(1)基因工程的核心步骤是________(填字母)。此过程所需的工具酶是 ‎____________________________。‎ ‎(2)下图乙是载体和反转录得到的胰岛素基因的片段，已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。Gene Ⅰ和Gene Ⅱ为质粒上的标记基因，根据图示分析，应用限制酶________切割质粒，用限制酶________切割目的基因。构建的重组质粒中，除含有外源基因、标记基因外，还必须含有________和________。‎ ‎(3)B过程中，常用________处理使细菌成为感受态细胞，从而利于重组质粒的导入。‎ ‎(4)如果从分子水平检测人胰岛素基因是否表达成功，可以采用______________方法。‎ 答案　(1)A　限制酶和DNA连接酶　(2)Ⅰ　Ⅱ　启动子　终止子　(3)Ca2＋　(4)抗原—抗体杂交 解析　(1)基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建，即图甲中的A过程，此过程所需的工具酶是限制酶和DNA连接酶。(2)若用限制酶Ⅰ切割质粒，则只破坏一个标记基因，若用限制酶Ⅱ切割质粒，则质粒上的两个标记基因均被破坏，所以应选用限制酶Ⅰ切割质粒；用限制酶Ⅱ切割目的基因；构建的重组质粒中，除含有外源基因、标记基因外，还必须含有启动子和终止子。(3)B过程是将目的基因导入受体细胞中，常用Ca2＋处理使细菌成为感受态细胞，从而利于重组质粒的导入。(4)如果从分子水平检测人胰岛素基因是否表达成功，可以采用抗原—抗体杂交方法。‎ ‎2．(2013·福建卷，33)克隆猪成功率较低，与早期胚胎细胞的异常凋亡有关。Bcl2‎ 基因是细胞凋亡抑制基因，用PCR技术可以检测该基因转录水平，进而了解该基因与不同胚胎时期细胞凋亡的关系。克隆猪的培育及该基因转录水平检测流程如图。‎ 请回答：‎ ‎(1)图中重组细胞的细胞核来自________细胞，早期胚胎移入受体子宫后继续发育，经桑椹胚、囊胚和______胚最终发育为克隆猪。‎ ‎(2)在PCR过程中可检测出cDNA中Bcl2 cDNA的分子数，进而计算总mRNA中Bcl2 mRNA的分子数，从而反映出Bcl2基因的转录水平。‎ ‎①图中X表示______过程。‎ ‎②从基因组数据库中查询Bcl2 mRNA的核苷酸序列，以便根据这一序列设计合成________用于PCR扩增，PCR过程第一轮循环的模板是________。‎ 答案　(1)体　原肠　(2)①反转录　②引物　Bcl2 cDNA 解析　(1)重组细胞的细胞核来自优良性状的亲本，据图可知，应由良种猪提供细胞核，所以细胞核来自良种猪的体细胞；早期胚胎发育过程经历了桑椹胚、囊胚和原肠胚等阶段。(2)①由图可知，X过程是由总mRNA到cDNA的过程，此过程属于中心法则中的反转录过程。②PCR扩增需要的条件是模板、原料、能量、酶和引物，而查询Bcl2 mRNA的核苷酸序列的目的是合成相关的引物用于PCR扩增，模板就是Bcl2 cDNA。‎ ‎3．(2013·新课标全国卷Ⅱ，40)甲、乙是染色体数目相同的两种二倍体药用植物，甲含有效成分A，乙含有效成分B。某研究小组拟培育同时含有A和B的新型药用植物。‎ 回答下列问题：‎ ‎(1)为了培育该新型药用植物，可取甲和乙的叶片，先用________酶和________酶去除细胞壁，获得具有活力的________，再用化学诱导剂诱导二者融合。形成的融合细胞进一步培养形成________组织，然后经过________形成完整的杂种植株。这种培育技术称为______________。‎ ‎(2)上述杂种植株属于多倍体，多倍体是指______________________________。假设甲与乙有性杂交的后代是不育的，而上述杂种植株是可育的，造成这种差异的原因是__________________________________________________。‎ ‎(3)这种杂种植株可通过制作人工种子的方法来大量繁殖。经植物组织培养得到的______________________________等材料用人工薄膜包装后可得到人工种子。‎ 答案　(1)纤维素　果胶　原生质体　愈伤　再分化(或分化)　植物体细胞杂交技术　(2)体细胞中含有三个或三个以上染色体组的个体(其他合理答案亦可)　在减数分裂过程中，前者染色体联会异常，而后者染色体联会正常(其他合理答案亦可)　(3)胚状体、不定芽、顶芽、腋芽 解析　(1)该新型药用植物是通过植物体细胞杂交技术获得的。要获得有活力的原生质体才能进行体细胞杂交，因此首先用纤维素酶和果胶酶去掉植物的细胞壁，然后用PEG化学诱导剂(物理方法：离心、振动等)诱导二者的原生质体融合。然后采用植物组织培养技术获得杂种植株，植物组织培养的主要过程是：先脱分化形成愈伤组织，然后再分化形成植物体，利用了植物细胞的全能性。(2)如果植物甲、乙是两个物种，二者不能通过有性杂交产生可育后代，原因是甲、乙有性杂交所产生的后代在减数分裂过程中同源染色体联会异常，也就是存在着生殖隔离。但植物甲、乙通过植物体细胞杂交技术产生的后代却是可育的，因为在减数分裂过程中同源染色体能完成正常的联会，产生正常的配子。由于甲、乙都是二倍体，因此，植物体细胞杂交得到的后代是异源多倍体(四倍体)。(3)人工种子具有生产不受气候、季节和地域等因素限制，而且可以避免后代发生性状分离等优点，因此，植物细胞工程重要的应用之一是制备人工种子，用到的核心技术是植物组织培养技术。将植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽、腋芽等材料用人工薄膜包装后可得到人工种子。‎ ‎4．如图是制备乙肝病毒表面抗体的流程，该抗体是乙肝病毒免疫的保护性抗体。回答以下问题：‎ ‎(1)图中抗原特指____________抗原，细胞Ⅱ是指____________。培养基中含有的某种天然成分是__________。‎ ‎(2)不考虑多细胞融合，那么第一次筛选淘汰的细胞有 ‎________________________________________，而第二次筛选得到的目的细胞是________________________________________________________。‎ ‎(3)从图中可知，培养目的细胞有两种途径，即____________________________。与普通抗体比较，得到的单克隆抗体具有________________________等优点。‎ ‎(4)该技术制备的单克隆抗体可用于基因工程的第四步工作，而该步工作中使用单克隆抗体的目的是______________________________________。‎ 答案　(1)乙肝病毒表面　骨髓瘤细胞　动物血清　(2)未融合的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞、骨髓瘤细胞间融合的细胞、B淋巴细胞间融合的细胞　能产生乙肝病毒表面抗体的杂交瘤细胞　(3)体外培养和体内培养　特异性强、灵敏度高，并可以大量制备　(4)检测目的基因是否成功表达 ‎5．(2013·山东卷，35)科学家通过诱导黑鼠体细胞去分化获得诱导性多能干细胞(iPS)，继而利用iPS细胞培养出与黑鼠遗传特性相同的克隆鼠，流程如下：‎ ‎(1)从黑鼠体内获得体细胞后，对其进行的初次培养称为____________，培养的细胞在贴壁生长至铺满培养皿底时停止分裂，这种现象称为 ‎________________________________________________________________________。‎ ‎(2)图中2细胞胚胎可用人工方法从灰鼠输卵管内获得，这过程称为____________，也可以从灰鼠体内取出卵子，通过________________后进行早期胚胎培养获得。‎ ‎(3)图中重组囊胚通过________________技术移入白鼠子宫内继续发育，暂不移入的胚胎可使用________________方法保存。‎ ‎(4)小鼠胚胎干细胞(ES)可由囊胚的________________分离培养获得。iPS与ES细胞同样具有发育的全能性，有望在对人类iPS细胞进行定向________________后用于疾病的细胞治疗。‎ 答案　(1)原代培养　接触抑制　(2)冲卵　体外受精 ‎(3)胚胎移植(或核移植)　冷冻(或低温)　(4)内细胞团　分化 解析　从黑鼠体内获得体细胞后，对其进行的初次培养称为原代培养，分瓶后的为传代培养；培养的细胞在贴壁生长至铺满培养皿底时停止分裂，这种现象称为细胞的接触抑制；细胞胚胎可从灰鼠输卵管内冲卵获得；重组囊胚通过胚胎移植技术移入白鼠子宫内，暂不进行胚胎移植的胚胎可放入－‎196 ℃‎的液氮中冷冻保存；胚胎干细胞简称ES或EK细胞，是由早期胚胎或原始性腺分离出来的一类细胞。内细胞团将来发育成胎儿的各种组织，可以作为干细胞的来源，iPS与ES细胞一样，可通过诱导定向分化修补某些功能异常的细胞来治疗疾病。‎ 专题巩固卷 ‎1．下图是利用基因工程方法培育抗虫棉的过程。请据图回答相关问题：‎ ‎(1)从苏云金芽孢杆菌的DNA上获取抗虫基因，需要用到的工具是____________，此工具主要是从____________生物中分离纯化出来的，它能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的________键断开。‎ ‎(2)构建重组质粒时，常用Ti质粒作为载体，是因为Ti质粒上具有________________，它能把目的基因整合到受体细胞________________。‎ ‎(3)E过程是利用____________________技术完成的，要确定抗虫基因导入棉花细胞后，是否赋予了棉花抗虫特性，在个体水平上还需要做________________实验。‎ ‎(4)将目的基因导入植物细胞，除采用上图中的方法外，还可采用________法和花粉管通道法。‎ 答案　(1)限制酶　原核　磷酸二酯　(2)TDNA　染色体DNA上　(3)植物组织培养　抗虫接种　(4)基因枪 解析　(1)限制酶用于切割DNA分子，获取目的基因。限制酶主要从原核生物细胞中获取。限制酶可断裂磷酸二酯键，将DNA分子切开。(2)Ti质粒是可转移DNA，其上的TDNA可以整合到植物细胞的染色体DNA上，故将目的基因借助Ti质粒导入植物细胞中。(3)E过程利用了植物组织培养技术。可把害虫接种到转基因植株上，以检测转基因植株的抗虫基因是否正常表达。‎ ‎2．下图一为含有目的基因的外源DNA，图二为某一般质粒，表中是几种限制酶识别序列及其切割位点。用图中的外源DNA与质粒构建重组质粒。‎ 限制酶 BamH Ⅰ Sma Ⅰ EcoR Ⅰ Hind Ⅲ 识别序列及切割位点 ‎↓‎ GGATCC　 CCTAGG ‎↓‎ CCCGGG GGGCCC ‎↓‎ GAATTC CTTAAG ‎↓‎ AAGCTT TTCGAA ‎↑　　‎ ‎↑‎ ‎↑‎ ‎↑‎ 请根据上述信息分析回答：‎ ‎(1)外源DNA、质粒分别有__________个游离的磷酸基团。‎ ‎(2)用Sma Ⅰ限制酶切割外源DNA，切开的是________________之间相连的键。‎ ‎(3)如果使用EcoR Ⅰ酶切割外源DNA和质粒，将目的基因片段与切割后的质粒混合，加入________酶，获得的环状DNA可能有________种情况。‎ ‎(4)如果使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理外源DNA和质粒，比用EcoR Ⅰ酶切割的优点是________________________________________。‎ ‎(5)经上述操作所得基因表达载体除________外，还必须有____________________，目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。‎ ‎(6)将重组质粒导入大肠杆菌中，培养基中需加入________进行鉴别和筛选含有重组质粒的细胞。‎ 答案　(1)2、0　(2)胞嘧啶脱氧核苷酸和鸟嘌呤脱氧核苷酸 ‎(3)DNA连接　3　(4)避免切割的外源DNA、质粒的黏性末端自身环化　(5)目的基因　启动子和终止子　(6)抗生素 ‎3．植物组织培养是克隆植物的一种方法，过程如图所示，回答相应的问题。‎ ‎(1)为了获得脱毒植株，外植体往往取自植物的花芽、叶芽等处的分生组织，其原因是____________________________。‎ ‎(2)培养皿中的培养基除添加营养物质外，还需要添加植物激素，其目的是诱导外植体________________。‎ ‎(3)在生产实践中为获得大量的细胞产物，如紫杉醇，可将①________放入液体培养基中，经机械作用分散成单个细胞，制备成细胞悬液，再经过________即可获得大量细胞。‎ ‎(4)组织培养过程需要提供植物生长和繁殖的最适条件，否则在光学显微镜下可能观察到发生________________异常，进而使植物出现遗传不稳定甚至不育等。‎ ‎(5)植物组织培养技术不仅应用于花卉和果树的快速大量繁殖以及脱毒植株的获取，还广泛用于__________________、________________、________________等育种过程中。‎ 答案　(1)这些部位还未受到病毒等病原体的侵害　(2)脱分化和再分化　(3)愈伤组织　细胞分裂　(4)染色体结构与数目　(5)植物体细胞杂交育种　基因工程育种　单倍体育种 解析　(1)刚长出的芽尖还没有受到病毒的侵染，因此用这些部位的细胞做植物组织培养的材料，可以获得脱毒植株。(2)在植物组织培养时，常用生长素和细胞分裂素来诱导外植体形成愈伤组织，生根、发芽，从而形成新的植物体。(3)一般利用外植体脱分化形成的愈伤组织获得细胞产物，愈伤组织有很强的分裂能力，通过培养愈伤组织细胞可获得大量细胞产物。(4)愈伤组织细胞分裂时易受环境条件影响而发生染色体结构或数目的异常，故需要在适宜的条件下进行组织培养。(5)植物体细胞杂交育种、基因工程育种、单倍体育种等育种过程均需要用到植物组织培养技术。‎ ‎4．2006年，我国培育出首例含绿色荧光蛋白基因(GFP)的克隆猪，它标志着我国在转基因克隆猪技术领域已达到世界领先水平。如图为该绿色荧光蛋白转基因克隆猪的培育过程示意图，请据图回答下列问题：‎ ‎(1)过程①将重组质粒导入猪胎儿成纤维细胞时，采用最多也最有效的方法是__________。然后，还要通过__________技术来检测绿色荧光蛋白基因是否已重组到猪胎儿成纤维细胞的染色体DNA上。‎ ‎(2)猪胎儿成纤维细胞培养过程中，细胞贴壁生长，数量不断增多，往往会发生____________现象，此时，需要用________等处理分散成细胞悬液。为了防止培养过程中的污染，通常还要在细胞培养液中添加一定量的________。‎ ‎(3)过程②实现的关键是对母猪进行________________处理。除此方法之外，还可从已处死的雌猪________中获取卵母细胞，采集到的卵母细胞需培养到________________期才可以进行过程③。‎ ‎(4)过程③表示____________，过程⑤表示____________。‎ 答案　(1)显微注射法　DNA分子杂交　(2)接触抑制　胰蛋白酶(或胶原蛋白酶)　抗生素　(3)注射促性腺激素　卵巢　减数第二次分裂中(MⅡ中)　(4)核移植　胚胎移植 解析　(1)过程①将重组质粒导入猪胎儿成纤维细胞时，采用最多也最有效的方法是显微注射法；要检测绿色荧光蛋白基因是否已经重组到猪胎儿成纤维细胞的染色体DNA上，可以采用DNA分子杂交技术。(2)‎ 猪胎儿成纤维细胞培养过程中，细胞贴壁生长，数量不断增多，往往会发生接触抑制现象，此时，需要用胰蛋白酶(或胶原蛋白酶)处理使之分散成细胞悬液；为了防止培养过程中的污染，通常还需要在细胞培养液中添加一定量的抗生素。(3)过程②是超数排卵过程，其实现的关键是对母猪注射促性腺激素；除此方法之外，还可以从已处死的雌猪卵巢中获取卵母细胞，采集到的卵母细胞需培养到减数第二次分裂中期(MⅡ中期)才可以进行过程③(核移植)。(4)过程③表示核移植，过程⑤表示胚胎移植。‎ ‎5．如图是某实验室做的通过动物纤维母细胞等获得单抗的实验研究。据图回答下列问题：‎ ‎(1)X、Y、Z细胞的名称分别是______________、______________________、______________。‎ ‎(2)①过程类似于植物组织培养技术中的__________过程。与纤维母细胞相比，诱导干细胞的全能性较______。②过程的实质是________________。‎ ‎(3)生产单克隆抗体一般不直接培养B淋巴细胞，主要原因是________________________________________。‎ ‎(4)④处需要筛选，从而得到________________________细胞，且培养该细胞的气体环境为____________________。‎ 答案　(1)骨髓瘤细胞　抗原刺激过的B淋巴细胞　杂交瘤细胞　(2)脱分化　高　基因的选择性表达 ‎(3)B淋巴细胞高度分化，不能无限(或大量)增殖　(4)能产生特异性抗体的杂交瘤　95%的空气＋5%的CO2‎ 解析　(1)图示过程为利用动物细胞工程获得单克隆抗体的过程，其中X细胞为骨髓瘤细胞，Y细胞为抗原刺激过的B淋巴细胞，Z细胞为X、Y两细胞杂交形成的杂交瘤细胞。(2)①过程是把小鼠的纤维母细胞诱导成为干细胞的过程，该过程类似于植物组织培养技术中的脱分化过程；纤维母细胞为分化的体细胞，其全能性低于诱导干细胞；②过程表示由诱导干细胞分化成为体细胞的过程，其实质是基因的选择性表达。(3)因为B淋巴细胞高度分化，不能无限(或大量)增殖，故一般不选用B淋巴细胞直接进行单克隆抗体的制备。(4)因③过程细胞杂交，可以形成骨髓瘤细胞＋骨髓瘤细胞，B细胞＋B细胞，B细胞＋骨髓瘤细胞三种杂交细胞，故需要经过筛选以获得能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，培养该细胞的气体环境为95%的空气＋5%的CO2。‎ ‎6．下图表示不同生物工程的操作过程，请据图回答下列问题：‎ ‎(1)若图为纯种荷斯坦奶牛的繁殖过程，A为良种公牛，B为雌性纯种荷斯坦奶牛，a 需要经过________处理，才能完成过程①。在操作③前，通过________技术可获得较多胚胎。‎ ‎(2)若图为培育转基因奶牛的过程，a表示人胰岛素基因，b表示载体，则过程①表示__________________________，它是基因工程的核心；过程②中常用________法将C导入细胞D；在过程③中，将细胞D置于5%的CO2的气体环境中，CO2的作用是____________________。‎ ‎(3)若C表示通过植物细胞工程获得的细胞，E表示试管苗，D表示______________，过程③应转接到________培养基上继续培养。整个过程必须在________________条件下培养。‎ 答案　(1)获能　胚胎分割　(2)基因表达载体的构建　显微注射　维持培养基(液)的pH　(2)愈伤组织、丛芽　分化　无菌和人工控制 ‎7．下图表示利用胚胎干细胞(ES细胞)所作的一系列研究，请据图回答下列问题：‎ ‎(1)上图中的胚胎干细胞(ES细胞)可以从____________或____________中分离获取。‎ ‎(2)过程Ⅰ将胚胎干细胞置于γ射线灭活的鼠胎儿成纤维细胞的饲养层上，并加入动物血清、抗生素等物质，维持细胞不分化的状态。在此过程中，饲养层提供干细胞增殖所需的________，加入抗生素是为了________________，该过程对于研究细胞分化和细胞凋亡的机理具有重要意义。‎ ‎(3)过程Ⅱ将带有遗传标记的ES细胞注入早期胚胎的囊胚腔，通过组织化学染色，用于研究动物体器官形成的时间、发育过程以及影响因素，这项研究利用了胚胎干细胞具有________________________的特点。在哺乳动物早期发育过程中，囊胚的后一个阶段是________。‎ ‎(4)过程Ⅲ是培育转基因小鼠，将获得的目的基因导入胚胎干细胞之前需构建基因表达载体，目的是 ‎________________________________________________________________________‎ ‎________________________________________________________________________‎ ‎________________________________________________________________________。‎ 将构建好的表达载体导入 胚胎干细胞最常用的方法是 ‎________________________________________________________________________。‎ ‎(5)过程Ⅳ得到的小鼠畸胎瘤里面全是软骨、神经管、横纹肌和骨骼等人类组织和器官。实验时，必须去除小鼠的胸腺，使其存在免疫缺陷，其目的是 ‎________________________________________，该过程研究的意义在于解决________________________________________________________________________‎ ‎________________________________________________________________________问题。‎ ‎(6)该研究中，包含的生物技术有______________________(至少写出两种)。‎ 答案　(1)早期胚胎　原始性腺　(2)营养物质　防止杂菌污染　(3)发育的全能性　原肠胚　(4)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用　显微注射法　(5)使移植组织细胞不会被排斥　临床上供体器官不足或器官移植后的免疫排斥等 ‎(6)动物细胞培养、基因工程、早期胚胎培养、胚胎移植 解析　(1)胚胎干细胞(ES细胞)可以从早期胚胎或原始性腺中分离获取。(2)胚胎干细胞培养时所用的饲养层细胞可以供给干细胞增殖所需的营养物质，加入抗生素是为了防止杂菌污染。(3)胚胎干细胞具有发育的全能性，通过组织化学染色，用于研究动物体器官形成的时间、发育过程以及影响因素。在哺乳动物早期发育过程中，囊胚的后一个阶段是原肠胚。(4)基因工程中，构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。将基因表达载体导入动物细胞最常用的方法是显微注射法。(5)去除小鼠的胸腺，小鼠不能形成T细胞，不能发生细胞免疫，使移植组织细胞不会被排斥。Ⅳ过程研究对于解决临床上供体器官不足或器官移植后的免疫排斥等问题有重要意义。(6)题中的研究过程包括动物细胞培养、基因工程、早期胚胎培养、胚胎移植等生物技术。‎ ‎8．2012年诺贝尔生理学或医学奖授予两位在细胞核重编程领域有重大贡献的科学家。科学家把cMyc等4个关键基因通过逆转录病毒载体转入小鼠的成纤维细胞，使其变成诱导多能干细胞——iPS细胞，这意味着未成熟的细胞能够发展成所有类型的细胞。‎ ‎(1)基因工程中经常使用的工具酶是__________________，常用的载体除了动植物病毒外还有________和________。‎ ‎(2)若想增强载体病毒颗粒的感染性，可利用____________技术改造病毒外壳蛋白，直接对________进行操作。‎ ‎(3)应用____________技术得到重组细胞，激活重组细胞发育成早期胚胎，使用从__________________________中获得的胚胎干细胞，在培养基中根据需要加入相应的小分子物质以促进其____________得到各种组织器官，用于治疗某些疾病，这种技术称为________________。‎ ‎(4)iPS细胞的获得不使用胚胎细胞或卵细胞，也不诱导发育成个体，因此不会像生殖性克隆一样引发________问题。‎ ‎(5)iPS细胞在体外已成功地被诱导分化为神经元细胞、神经胶质细胞、心血管细胞和原始生殖细胞等，究其本质原因是基因________________的结果。‎ 答案　(1)限制酶和DNA连接酶　质粒　噬菌体　(2)蛋白质工程　基因　(3)核移植　早期胚胎或原始性腺　定向分化　治疗性克隆　(4)伦理学　(5)选择性表达 解析　(1)基因工程中经常使用的工具酶是限制酶和DNA连接酶，常用的载体除了动植物病毒外还有质粒和λ噬菌体的衍生物。(2)载体病毒颗粒的感染性是由病毒的蛋白质外壳决定的，所以要增强其感染性，可利用蛋白质工程改造病毒蛋白质外壳；要改造蛋白质，可直接对控制合成该蛋白质的基因进行操作，通过改造基因实现对蛋白质的改造。(3)应用核移植技术得到重组细胞，激活重组细胞发育成早期胚胎，使用从早期胚胎或原始性腺中获得的胚胎干细胞，在培养基中根据需要加入相应的小分子物质促进其定向分化得到各种组织器官，用于治疗某些疾病，这种技术称为治疗性克隆。(4)iPS细胞的获得不使用胚胎细胞或卵细胞，不诱导发育成个体，因此不会像生殖性克隆那样引发伦理学问题。(5)细胞分化是基因选择性表达的结果。‎ ‎9．胚胎工程是一项综合性很强的动物繁育技术，可在畜牧业和制药业等领域发挥重要作用。下图是通过胚胎工程培养试管牛的过程。‎ ‎ (1)从良种母牛采集的卵母细胞，都需要进行体外培养，其目的是__________________________；从良种公牛采集的精子需________后才能进行受精作用。‎ ‎(2)在体外培养受精卵时，除了给予一定量的O2以维持细胞呼吸外，还需要提供________气体以维持____________。‎ ‎(3)图中过程A称为________________，它在胚胎工程中的意义在于__________________________。‎ ‎(4)研制能够产生人类白细胞介素的牛乳腺生物反应器，需将目的基因导入牛受精卵，最常用的导入方法是________；获得转基因母牛后，如果__________________________即说明目的基因已经表达。‎ 答案　(1)使卵母细胞成熟(或：使卵母细胞获得受精能力)　获能　(2)CO2　培养液(基)的pH　(3)胚胎移植　提高优良母畜的繁殖率　(4)显微注射法　牛奶中含有人类白细胞介素(或：牛乳腺细胞已合成人类白细胞介素)‎ 解析　刚获取的卵母细胞还没有发育成熟，不能与精子受精，需要在人工模拟环境(如温度、营养、pH等)条件下，使获取的卵母细胞成熟，采集的精子要进行获能处理，获能方法有培养法和化学诱导法；在培养受精卵时，需要提供一定的CO2用来维持培养液的pH的稳定；胚胎移植是胚胎工程实施过程的重要一环，可以充分发挥优良个体的繁殖能力，大大推动畜牧业的发展；目的基因导入动物受精卵大多采用显微注射法，转基因 成功与否，就是看是否有目的基因控制的产物合成。‎