【生物】2018届一轮复习人教版专题26-2基因工程的基本操作程序学案

【生物】2018届一轮复习人教版专题26-2基因工程的基本操作程序学案

专题二十六 《现代生物科技专题》专题1 基因工程 第2课 基因工程的基本操作程序 ‎【学案导航】---明方向！‎ ‎【课程学习目标】‎ ‎1. 简述基因工程原理及基本操作程序。‎ ‎2. 尝试设计某一转基因生物的研制过程。‎ 第一层级：预学区.不看不讲 ‎【知识体系梳理】‎ 一、目的基因的获取：‎ ‎1．目的基因：符合人们需要的，编码蛋白质的 。‎ ‎2．获取目的基因的方法 ‎(1)从基因文库中获取目的基因 ‎①基因文库：将含有某种生物不同基因的许多 ，导入受体菌的群体中 ，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。‎ ‎②‎ ‎③目的基因的获取 根据基因的有关信息：基因的 序列、基因在 上的位置、基因的 产物mRNA、基因的 产物蛋白质等特性获取目的基因。‎ ‎(2)利用PCR技术扩增目的基因 ‎①PCR：是一项在生物体外 特定DNA片段的核酸合成技术。‎ ‎②条件：已知目的基因的 序列。‎ ‎③过程：目的基因DNA受热形成 ，与 结合，然后在_________的作用下进行延伸形成DNA。‎ ‎④方式：指数扩增=2n(n为扩增循环的次数)‎ ‎(3)人工合成法：基因较小，核苷酸序列已知，可以人工合成。‎ 二、基因表达载体的构建 ‎1．表达载体的组成：目的基因+ + +标记基因等。‎ ‎2．启动子：位于基因的 ，它是 和结合的部位，驱动基因转录产生mRNA。‎ ‎3．终止子：位于基因的 ，终止 。‎ ‎4．标记基因： 受体细胞是否含有目的基因。‎ ‎5．表达载体的功能：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且 给下一代；同时使目的基因_________________和发挥作用。‎ ‎6．不同的受体细胞及目的基因导入受体细胞的方法不同，基因表达载体的构建上也会有所差别。‎ 三、将目的基因导入受体细胞 ‎(一)转化：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和 的过程。‎ ‎(二)方法 ‎1．将目的基因导入植物细胞 ‎(1)农杆菌转化法 ‎①农杆菌特点：易感染 植物和裸子植物，对___________植物没有感染力；Ti质粒的 可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体上。‎ ‎②转化：目的基因插入 农杆菌→导入植物细胞→目的基因整合到植物细胞染色体上→目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。‎ ‎(2)基因枪法 ‎ 基因枪法：是单子叶植物中常用的一种基因转化方法，但是成本较高。‎ ‎(3)花粉管通道法 ‎ 花粉管通道法：这是我国科学家独创的一种方法，是一种十分简便经济的方法。（我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的）‎ ‎2．将目的基因导入动物细胞 ‎(1)方法： 注射技术。‎ ‎(2)操作程序：目的基因表达载体 →取卵(受精卵) →显微注射→注射了目的基因的受精卵移植到____性动物的____________________内发育→新性状动物。‎ ‎3．将目的基因导入微生物细胞 ‎(1)原核生物特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。‎ ‎(2)大肠杆菌最常用的转化方法是： 处理细胞→ 细胞→表达载体与感受态细胞混合→ _________ 细胞吸收DNA分子。‎ 四、目的基因的检测与鉴定 ‎1．检测 ‎ (1)方法：核酸分子杂交技术、抗原—抗体分子杂交方法。‎ ‎ (2)内容 ‎ ①检测转基因生物染色体的DNA是否插入 。‎ ‎ ②检测目的基因是否转录成 。‎ ‎ ③检测目的基因是否翻译成 。‎ ‎2．鉴定： 鉴定、抗病鉴定等。‎ ‎【预习效果检测】‎ ‎1．下列属于获取目的基因的方法的是(　　)‎ ‎①利用mRNA反转录形成 ②从基因组文库中提取 ‎③从受体细胞中提取 ④利用PCR技术 ‎⑤利用DNA转录 ⑥人工合成 A．①②③⑤ B．①②⑤⑥‎ C．①②③④ D．①②④⑥‎ ‎2．哪些是基因表达载体的必需组成部分(　　)‎ ‎①启动子 ②终止密码子 ‎③标记基因 ④目的基因 ‎⑤终止子 A．①②③④ B．①③④⑤‎ C．①②④⑤ D．①②③⑤‎ ‎3．不属于目的基因与运载体结合过程的是(　　)‎ A．用一定的限制酶切割质粒，露出黏性末端 B．用同种限制酶切割目的基因，露出黏性末端 C．将切下的目的基因插入质粒的切口处 D．将重组DNA导入受体细胞进行扩增 ‎4．在判断抗虫基因是否成功转入棉花基因组的方法中，不属于分子检测的是(　　)‎ A．通过观察害虫吃棉叶是否死亡 B．检测目的基因片段与DNA探针能否形成杂交带 C．检测目的基因转录形成的mRNA与DNA探针能否形成杂交带 D．检测目的基因表达产物蛋白质能否与特定抗体形成杂交带 ‎5．右图为基因表达载体的模式图，下列有关基因工程中载体的说法错误的是(　　) ‎ A．基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建 B．任何基因表达载体的构建都是一样的，没有差别 C．图中启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位 D．抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因 第二层级：导学区.不议不讲 ‎【重点难点探究】‎ ‎1.基因工程的基本操作程序是什么？‎ ‎2.目的基因的概念是什么？ ‎ ‎ ‎ ‎3.目的基因的获取的方法是什么？‎ ‎ ‎ ‎4.如何合成cDNA？‎ ‎5.怎样从基因文库中找到我们所需要的目的基因？ ‎ ‎ ‎ ‎6.人工合成的目的基因是否具有完整基因结构的基因？‎ ‎7.基因表达载体的组成和作用分别是什么？‎ ‎8.若通过基因过程生产人的糖蛋白可以用大肠杆菌作为工程菌吗？ ‎ ‎9.导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组 DNA分子吗？‎ ‎ ‎ ‎10.目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？ ‎ ‎11.如何检测目的基因已经导入受体细胞？‎ ‎12.受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？ ‎ 第三层级：固学区.不练不讲 ‎【基础智能检测】‎ ‎1．以下有关基因工程的叙述，正确的是(　　)‎ A．利用PCR技术可以大量扩增目的基因 B．目的基因导入受体细胞最常用的方法是农杆菌转化法 C．用同一种限制酶分别切割载体和目的基因的目的是能够产生不同的黏性末端 D．利用载体上标记基因的相关特性就可检测出目的基因已导入受体细胞并成功表达 ‎2．下列关于目的基因导入受体细胞的描述，不正确的是(　　)‎ A．利用基因枪法将目的基因导入植物体细胞的方法比较经济有效 B．显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法 C．大肠杆菌细胞最常用的转化方法是使细胞的生理状态发生改变 D．农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法 ‎3．基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋白质。下列叙述不正确的是(　　)‎ A．常用相同的限制性核酸内切酶处理目的基因和质粒 B．常用Ca2＋处理大肠杆菌，有利于目的基因与载体的结合 C．可通过检测标记基因来检测重组质粒是否成功导入受体细胞 D．导入大肠杆菌的目的基因不一定能成功表达 ‎4．下列关于基因表达载体导入微生物细胞的叙述中，不正确的是(　　)‎ A．常用原核生物作为受体细胞，是因为原核生物繁殖快，且多为单细胞，遗传物质相对较少 B．受体细胞所处的一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态称为感受态 C．感受态细胞吸收DNA分子需要适宜的温度和酸碱度 D．感受态细胞吸收重组表达载体DNA分子的液体只要调节为适宜的pH即可，没必要用缓冲液 ‎5.回答有关基因工程的问题：‎ ‎(1)构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割DNA后，可能产生黏性末端，也可能产生________末端。若要在限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生______(相同、不同)黏性末端的限制酶。‎ ‎(2)利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建的表达载体含有人胰岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是__________________。在用表达载体转化成为大肠杆菌时，常用__________处理大肠杆菌，以利于表达载体进入；为了检测胰岛素基因是否转录出了mRNA，可用标记的胰岛素基因片段作探针与mRNA杂交，该杂交技术称为__________________。为了检测胰岛素基因转录的mRNA是否翻译成__________，常用抗原——抗体杂交技术。‎ ‎(3)如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植物细胞，先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的______________中，然后用该农杆菌感染植物细胞，通过DNA重组将目的基因插入植物细胞的____________上。‎ 第四层级：思学区.不思不复 ‎【思维导图构建】‎ ‎【答案】‎ ‎【知识体系梳理】‎ 一、1.结构基因 2.（1）①DNA片段 储存 ② 全部 一部分 ③ 核苷酸 染色体 转录 翻译 ‎（2）①复制 ② 核苷酸 ③ 单链 引物 DNA聚合酶 ‎ 二、1. 启动子 终止子 2.首端 RNA聚合酶识别 3.尾端 转录 4.鉴别 5.可以遗传 能够表达 ‎ 三、（一）表达 （二）（1）1. ①双子叶 单子叶 T—DNA ②Ti质粒的T—DNA ‎ ‎2. (1) 显微 (2)提纯 雌 输卵管或子宫 3.（1）Ca2+ 感受态 感受态 ‎ 四、目的基因 mRNA 蛋白质 抗虫 ‎ ‎【预习效果检测】‎ ‎1．D【解析】　受体细胞是接受目的基因并使之表达的细胞。DNA转录形成信使RNA。目的基因属于外源基因，不能从受体细胞中提取。利用DNA转录合成的是RNA不是目的基因。学*科网 ‎2. B【解析】　启动子位于基因表达载体的首端，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质；终止子相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停止下来；标记基因是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来；目的基因是表达载体上必须具有的结构。‎ ‎3.D【解析】目的基因与运载体结合的过程就是构建重组DNA的过程。‎ ‎5.B【解析】由于受体细胞有植物、动物和微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方式不同，所以基因表达载体的构建也会有所差别，不可能千篇一律。‎ ‎【重点难点探究】‎ ‎1. 目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 ‎2．主要是指编码蛋白质基因，也可以是一些具有调控作用的因子。例如：与生物抗逆性相关的基因，与生物优良品质相关的基因，药物和保健品相关的基因，与毒物降解相关的基因，以及与工业所需要酶相关的基因。‎ ‎3.（1）从基因库中获取目的基因（2）应用PCR技术扩增目的基因（3）用化学方法直接人工合成目的基因。‎ ‎4. 第一步：反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步：核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。第三步：以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。‎ ‎5. 根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。‎ ‎6. 不具有，缺少非编码区(启动子、终止子）和非编码序列（如内含子），要人工构建。‎ ‎7.组成：(1)目的基因 (2)启动子：是RNA聚合酶识别和结合部位(3)终止子：是使转录在需要的地方停止(4)标记基因：是鉴别受体细胞中是否含有目的基因从而将含有目的基因的细胞筛选出来 作用：①使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代；②同时使目的基因能表达和发挥作用。‎ ‎8.不可以，糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加工完成，而内质网和高尔基体存在真核细胞中，大肠杆菌是原核生物，细胞中不含这两种细胞器。‎ ‎9.真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。‎ ‎10. 不一定，需要检测 ‎11. 分子杂交技术：（1）DNA分子与DNA分子的之间杂交。（2）DNA分子与RNA分子的之间杂交。（3）蛋白质分子（抗原与抗体）之间杂交。‎ ‎12．不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。‎ ‎【基础智能检测】‎ ‎1.A 【解析】　PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法；用同一种限制酶分别切割载体和目的基因的目的是能够产生相同的黏性末端，便于两者连接；利用载体上标记基因的相关特性就可检测出目的基因已导入受体细胞，但不能确定目的基因是否得以表达。‎ ‎2.A【解析】　本题综合考查将目的基因导入受体细胞的方法。目的基因导入不同的生物其方法不同，每种方法都有利有弊。目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，该方法比较经济和有效，此外还有基因枪法和花粉管通道法；目的基因导入动物细胞常用显微注射技术；大肠杆菌细胞最常用的转化方法就是用Ca2＋处理细胞，使细胞的生理状态发生改变，进而完成转化过程。‎ ‎3.B【解析】将目的基因导入微生物细胞时，常用Ca2＋处理微生物细胞，如大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞，利于基因的导入。‎ ‎5. 【答案】　(1)平　相同 (2)RNA聚合酶识别和结合的部位　Ca2＋　核酸分子杂交技术　蛋白质 ‎(3)T－DNA片段　染色体DNA ‎【解析】（1）限制酶切割DNA后，其结果可能产生黏性末端，也可能产生平末端。DNA连接酶是将具有相同黏性末端的DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，所以若要在限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生相同黏性末端的限制酶。‎ ‎（2）启动子位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质，所以启动子的作用是提供RNA聚合酶特异性识别结合位点，驱动基因转录。在用表达载体转化大肠杆菌时，常用Ca2+处理大肠杆菌。检测胰岛素基因是否转录出了mRNA，可采用DNA—RNA分子杂交技术。胰岛素基因转录的mRNA的翻译产物是胰岛素原（蛋白质）。‎ ‎（3）采用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞，先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的T—DNA中，然后用该农杆菌感染植物细胞，通过DNA重组将目的基因插入植物细胞中的染色体DNA上。学*科网 ‎【典例指津】---授技法！‎ 热点题型一 基因工程的基本操作程序 例1、将目的基因导入微生物细胞的最常用方法是 A．感受态细胞法 ‎ B．显微注射法 C．基因枪法 ‎ D．农杆菌转化法 ‎【答案】A ‎【提分秘籍】‎ 基因工程的基本操作程序： 1、目的基因的获取 （1）目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因。 （2）获取方法：①从基因文库中获取；②人工合成（反转录法和化学合成法）；③PCR技术扩增目的基因。 2、基因表达载体的构建 （1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 （2）组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。[]‎ ‎①启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。 ②终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。 ③标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。 3、将目的基因导入受体细胞 （1）转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 （2）常用的转化方法：‎ 生物种类 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 农杆菌转化法 显微注射技术 Ca2+处理法 受体细胞 体细胞 受精卵 原核细胞 转化过程 将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子 ‎（3）重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。 4、目的基因的检测和表达 （1）首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。 （2）其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。 （3）最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原--抗体杂交。  （4）有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。‎ ‎【举一反三】 ‎ 下列把目的基因导入受体细胞的描述不正确的是（　　）‎ A. 导入单子叶植物细胞常用农杆菌转化法 B. 导入大肠杆菌常用Ca2+处理细胞 C. 导入动物乳腺细胞中即可获得乳腺生物反应器 D. 花粉管通道法是一种十分简便经济的方法 ‎【答案】AC ‎【解析】在自然条件下，农杆菌感染双子叶植物和裸子植物，因此农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法，但大多数单子叶植物不能用，A错误；Ca2+处理法能使大肠杆菌细胞的生理状态发生改变，使之成为易于吸收周围环境中DNA分子的感受态，所以将目的基因导入微生物细胞，常采用感受态细胞法（Ca2+处理法），B正确；乳腺生物反应器是将某种药用蛋白基因导入动物受精卵，然后该受精卵发育形成的个体，C错误；花粉管通道法是我国科学家独创的一种方法，是一种十分简便经济的方法，我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的，D正确．故选：AC．‎ 热点题型二 获取目的基因的方法 例2、获取目的基因的方法有多种，下列不属于目的基因获取方法的是（　　）‎ A．从基因组文库中获取 B．从cDNA文库中获取 C．从含目的基因生物细胞中获取 D．利用PCR技术获取 ‎【答案】C ‎【提分秘籍】‎ 一、知识点拨：‎ ‎1、构建基因文库的目的为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。 ‎ ‎2、PCR技术：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。PCR扩增是获取目的基因的一种非常有用的方法，也是进行分子鉴定和检测的一种很灵敏的方法。目的：通过指数式扩增获取大量的目的基因。 ‎ ‎3、基因文库中不是直接保管相应基因，基因文库中的基因保存在受体菌中。 ‎ ‎4、在基因工程的四个操作步骤中，只有第三步将目的基因导入受体细胞不需碱基互补配对，其余三个步骤都涉及碱基互补配对。‎ ‎5、原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，有利于目的基因的复制与表达，因此常用大肠杆菌等原核生物作为受体细胞。 ‎ ‎6、植物细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程成为完整植物体，因此受体细胞可以是受精卵也可以是体细胞；动物基因工程中的受体细胞一般是受精卵。‎ ‎7、转化的实质是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中，从而使受体生物获得了新的遗传特性的现象，从其变化的实质看，这种变异属于可遗传变异中的基因重组。‎ 二、获取目的基因的方法 ‎1、从基因文库中直接获取 基因文库的构建： （1）概念 ①基因组文库：含有一种生物的全部基因。将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因组文库。  ②cDNA文库：只包含了一种生物的部分基因。  （2）构建过程 基因组文库的构建 cDNA文库的构建 ‎2、人工合成目的基因 （1）反转录法： （2）人工合成目的基因 3、PCR技术扩增目的基因 ①原理：DNA双链复制 ②过程： 第一步：加热至90～95℃，DNA解链； 第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链； 第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。‎ ‎【举一反三】‎ 白细胞介素是一类淋巴因子。研究人员将人白细胞介素的基因导入到酵母细胞中，使其分泌出有活性的人白细胞介素。‎ ‎(1)在体液免疫过程中，白细胞介素是由____________细胞分泌的，可作用于受到抗原刺激的B细胞，使B细胞增殖、分化，形成___________细胞。 (2)目的基因获取：从健康人体外周静脉血分离得到淋巴细胞，于37℃培养48h，提取细胞总RNA，生成cDNA。根据已知目的基因的核苷酸序列合成引物，通过PCR扩增获取目的基因，此时需要加入的反应物与生成eDNA时所加反应物不同的是__________。 (3)重组载体的构建：用两种限制酶EcoR1与EcoR52处理载体和目的基因后，用__________酶处理，形成重组载体。该载体与细胞膜载体的化学本质分别是_____________和____________。‎ ‎【答案】(1)T 浆细胞和记忆 (2)模板cDNA、耐高温(热稳定)DNA聚合酶(Taq酶)、引物 ‎(3)DNA连接 核酸 蛋白质 ‎【真题回眸】---知难易！‎ ‎1.(2016全国卷Ⅰ) [生物——选修3：现代生物科技专题]‎ 某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用BamHI酶切后，与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：‎ ‎（1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有______________（答出两点即可）。‎ 而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。‎ ‎（2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是______________________________；并且______________和___________________________的细胞也是不能区分的，其原因是__________________________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有__________的固体培养基。‎ ‎（3）基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于_____________‎ ‎【答案】（1）能自我复制、具有标记基因 ‎（2）二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒（或答含有重组质粒）‎ 二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素 ‎（3）受体细胞 ‎2.(2016全国卷Ⅲ) 图（a）中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR I、BamH I和Sau3A I三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图（b）为某种表达载体示意图（载体上的EcoRI、Sau3AI的切点是唯一的）。‎ ‎ ‎ 根据基因工程的有关知识，回答下列问题：‎ ‎（1）经BamH I酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被____________酶切后的产物连接，理由是________________________________________________。‎ ‎（2）若某人利用图（b）所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图（c）所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有____________，不能表达的原因是__________‎ ‎___________________________。‎ ‎（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有____________和____________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是____________。‎ ‎【答案】（1）Sau3AⅠ 限制酶Sau3AⅠ与BamHⅠ切割后形成的黏性末端相同 ‎（2）甲、丙 在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样目的基因才能表达。图中甲、丙均不符合，所以不能表达目的基因的产物 ‎（3）E·coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 T4DNA连接酶 ‎3.（2016江苏卷）下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：‎ ‎ ‎ ‎（1）用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用__________________两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过__________酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于________态的大肠杆菌。‎ ‎（2）为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加___________________，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中_____________。‎ ‎（3）若BamH I酶切的DNA末端与Bcl I酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为 _________，对于该部位，这两种酶 （填“都能”、“都不能”或“只有一种能”）切开。‎ ‎（4）若用Sau3A I切图1质粒最多可能获得 种大小不同的DNA片段。‎ ‎【答案】（1）BclI和HindⅢ DNA连接 感受 （2）四环素 引物甲和引物丙 ‎（3） 都不能 （4）7‎ ‎【解析】（1）选择的限制酶应在目的基因两端存在识别位点，但BamH I可能使质粒中启动丢失，因此可能选Bcl I和HindⅢ。酶切后的载体和目的基因片段，通过DNA连接酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于感受态的大肠杆菌。‎ ‎（2）为了筛选出转入重组质粒的大肠杆菌，根据质粒上的抗性基因，应在筛选平板培养基中添加四环素。PCR技术要求两种引物分别和目的基因的两条单链结合，沿相反的方向合成子链。‎ ‎（3）根据BamH I和Bcl I的酶切点，BamHI酶切的DNA末端与Bcl I酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为 ，与两种酶的酶切位点均不同。‎ ‎(4)根据BamH I、Bcl I和Sau3A I的酶切位点，Sau3A I在质粒上有三个酶切位点，完全酶切可得到记为A、B、C三种片段，若部分位点被切开，可得到AB、AC、BC、ABC四种片段，所以用Sau3A I切图1质粒最多可能获得7种大小不同的DNA片段。‎ ‎【能力提升】---长士气！ ‎ 一、选择题 ‎1．利用基因工程技术可使大肠杆菌生产人的胰岛素。下列相关叙述正确的是(　　)‎ A．人和大肠杆菌在合成胰岛素时，转录和翻译的场所是相同的 B．DNA连接酶能把两个黏性末端经碱基互补配对后留下的缝隙“缝合”‎ C．通过检测，大肠杆菌中没有胰岛素产生则可判断重组质粒未导入受体菌 D．在培养大肠杆菌的工程菌的过程中，获得目的基因的工具酶有限制酶、DNA聚合酶 ‎【答案】B ‎【解析】大肠杆菌为原核生物，在合成胰岛素时，其转录和翻译的场所与人存在差异；检测发现大肠杆菌中无胰岛素产生，可能的原因有：①未导入，②导入后未表达；在培养大肠杆菌的工程菌的过程中，获得目的基因的工具酶是限制酶，不用DNA聚合酶。‎ ‎2．下图表示一项重要的生物技术，对图中物质a、b、c、d的描述，正确的是(　　)‎ A．a通常存在于细菌体内，是目前该生物技术中唯一的运载体 B．b识别特定的核苷酸序列，并将A与T之间的氢键切开 C．c连接双链间的A和T，使黏性末端处碱基互补配对 D．若要获得已知序列的d，可采用化学合成方法 ‎【答案】D ‎3．下图是将人的生长激素基因导入细菌B内制造“工程菌”的示意图。已知细菌B内不含质粒A，也不含质粒A上的基因。判断下列说法正确的是(　　)‎ A．将重组质粒导入细菌B常用显微注射技术 B．将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，能生长的就是导入了重组质粒的细菌 C．将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的就是导入了质粒A的细菌 D．目的基因成功表达的标志是受体细胞能在含有氨苄青霉素的培养基上生长 ‎【答案】C ‎【解析】将目的基因导入细菌时，常用Ca2+处理细菌，使之处于感受态，从而能够吸收重组质粒，A错误；由于抗氨苄青霉素基因未被破坏，所以在含有氨苄青霉素的培养基上能生长的是导入普通质粒A的细菌和导入重组质粒的细菌，B错误；由于抗四环素基因被破坏，所以能在含有四环素的培养基上生长的是导入普通质粒A的细菌，C正确；目的基因成功表达的标志是工程菌生产出人的生长激素，D错误。故选C。‎ ‎4．继在上海和安徽首次发现H7N9禽流感病例，我国多地出现禽流感疫情，为此某研究小组为了研制预防H7N9禽流感病毒的疫苗，开展了前期研究工作。其简要的操作流程如下图。下列有关叙述错误的是(　　)‎ A．步骤①所代表的过程是反转录 B．步骤②需使用限制酶和DNA连接酶 C．步骤③可用CaCl2处理大肠杆菌，使其从感受态恢复到常态 D．检验Q蛋白的免疫反应特性，可用Q蛋白与患禽流感康复的鸡的血清进行抗原——抗体特异性反应实验 ‎【答案】C ‎5．基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，无需进行碱基互补配对的步骤是(　　)‎ A．人工合成目的基因　　　 B．基因表达载体的构建 C．将目的基因导入受体细胞 D．目的基因的检测与鉴定[]‎ ‎【答案】C ‎【解析】将目的基因导入受体细胞时，不存在DNA复制或转录等过程，故该过程不需进行碱基互补配对。‎ ‎6．利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列各项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是(　　)‎ A．棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因 B．大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNA C．山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列 D．酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白 ‎【答案】D ‎7．基因工程中因受体细胞不同，目的基因导入的方法也不同，下列叙述不正确的是(　　)‎ A．将目的基因导入棉花细胞内常用花粉管通道法 B．将目的基因导入老鼠细胞内常用显微注射法 C．将目的基因导入大肠杆菌内常用感受态细胞转化法 D．将目的基因导入小麦细胞内常用农杆菌转化法 ‎【答案】D ‎【解析】小麦是单子叶植物，其受伤后不能分泌酚类物质，农杆菌对它没有感染能力。学*科网 ‎8．天然的玫瑰没有蓝色花，这是由于缺少控制蓝色色素合成的基因B，而开蓝色花的矮牵牛中存在序列已知的基因B，现用基因工程技术培育蓝玫瑰，下列操作正确的是(　　)‎ A．提取矮牵牛蓝色花的mRNA，经过逆转录获得互补的DNA，再扩增基因B B．利用限制性核酸内切酶从开蓝色花牵牛的基因文库中获取基因B C．利用DNA聚合酶将基因B与质粒连接后导入玫瑰细胞 D．将基因B直接导入大肠杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞 ‎【答案】A ‎【解析】由题意知：控制蓝色色素合成的基因B是目的基因，提取矮牵牛蓝色花的mRNA，经反转录获得互补的DNA，再扩增基因B，然后导入天然玫瑰的细胞中，培育该受体细胞即能获得蓝玫瑰。限制酶用于切割目的基因而不是获取目的基因；将目的基因B与质粒连接需用DNA连接酶，而不是DNA聚合酶；基因B需与质粒连接形成基因表达载体再导入农杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞，而不能将基因B直接导入大肠杆菌。‎ 二、非选择题 ‎9．1997年，科学家将动物体内的能够控制合成胰岛素的基因与大肠杆菌的DNA分子重组，并且在大肠杆菌中表达成功。请据下图回答问题。‎ ‎(1)此图表示的是采取________合成基因的方法获取目的基因的过程。‎ ‎(2)图中①互补DNA是以__________________________为模板，形成单链DNA，在酶的作用下合成双链DNA，从而获得了所需要的目的基因。‎ ‎(3)图中③代表____________，它往往含____________基因，以便于目的基因的检测。‎ ‎(4)图中④表示________________________，为使此过程顺利进行，一般须将大肠杆菌用__________处理，以增大其细胞壁的____________。‎ ‎(5)图中⑤表示________随大肠杆菌的繁殖而进行增殖，此目的基因在大肠杆菌内表达的标志是________________________。‎ ‎【答案】(1)人工 (2)控制胰岛素合成的信使RNA (3)重组DNA分子　 标记 ‎(4)将目的基因导入受体细胞　氯化钙　通透性 ‎(5)目的基因　大肠杆菌能产生胰岛素 ‎【解析】（1）分析图解可知，图中通过反转录法合成目的基因，即表示采取人工合成方法获取原胰岛素目的基因的过程．‎ ‎（2）图中①DNA是以控制胰岛素合成的mRNA为模板，反转录形成单链DNA，在酶的作用下合成双链DNA，从而获得了所需要的胰岛素基因．‎ ‎（3）图中③代表重组DNA分子，其组成包括目的基因、标记基因、启动子和终止子等，其中标记基因的作用是对目的基因的检测．‎ ‎（4）图中④表示目的基因导入受体细胞．由于DNA分子都是独特的双螺旋结构，且都是由四种脱氧核苷酸组成的，因此动物的胰岛素基因能和大肠杆菌的基因拼接在一起．‎ ‎（5）图中⑤表示目的基因随大肠杆菌的繁殖而进行增殖，此目的基因在大肠杆菌内表达的标志是大肠杆菌能产生人的胰岛素。‎ ‎10．如图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性核酸内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，ampR 为青霉素抗性基因，tetR为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别含有包含EcoRⅠ、BamHⅠ在内的多种酶的酶切位点。‎ ‎ ‎ ‎(1)将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRⅠ酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有________、________、________三种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行________。‎ ‎(2)用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是________。‎ ‎(3)目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是________，其合成的产物是________。‎ ‎(4)在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是________。‎ ‎【答案】(1)目的基因—载体连接物　载体—载体连接物　目的基因—目的基因连接物　分离纯化 ‎(2)载体—载体连接物 ‎(3)启动子　mRNA ‎(4)EcoRⅠ和BamHⅠ(只答一种酶不可)‎ ‎【解析】（1）由于含有目的基因的DNA片段和质粒上均含有EcoRI酶的切割位点，所以用此酶切割后产生相同的黏性末端．这样，具有相同黏性末端的片段用DNA连接酶均可连接，从而产生3种连接产物，即：目的基因—载体连接物、载体—载体连接物、目的基因—目的基因连接物，所以要进行分离纯化。‎ ‎（2）由于将细胞放入含四环素的培养基，要将存活tctR 为四环素抗性基因结构要保持完整，用EcoRI酶切后再用连接酶连接的三种产物只有载体﹣载体连接物基因结构保持完整。‎ ‎（3）目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是启动子，其合成的产物是RNA。‎ ‎（4）防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，需要有两种限制酶，而ampR为青霉素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点，结构不能被破坏，故选择EcoRⅠ和BamHⅠ这两种限制酶。‎