【生物】2021届一轮复习人教版微生物的培养与应用教案（湖北专用）

【生物】2021届一轮复习人教版微生物的培养与应用教案（湖北专用）

第31讲　微生物的培养与应用 课程内容 核心素养——提考能 ‎1.进行微生物的分离和培养 ‎2.用大肠杆菌为材料进行平面培养、分离菌落 ‎3.测定某种微生物的数量 ‎4.分离土壤中分解尿素的细菌 ‎5.研究培养基对微生物的选择作用 科学思维 分析培养基的成分及作用，比较平板划线法与稀释涂布平板法的异同 科学探究 设计实验获得纯化的酵母菌落 社会责任 关注有害微生物的控制、宣传健康生活 考点一　微生物的实验室培养 ‎1.微生物的培养基 ‎(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。‎ ‎(2)营养组成：一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。此外，还需要满足微生物生长对pH、氧气以及特殊营养物质的要求。‎ ‎(3)种类 ‎①按照物理性质可分为液体培养基、固体培养基、半固体培养基。‎ ‎②按照成分的来源可分为天然培养基和合成培养基、半合成培养基。‎ ‎③按照功能用途可分为选择培养基、鉴别培养基等。‎ ‎2.无菌技术 ‎(1)含义：在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。‎ ‎(2)作用：防止外来杂菌的入侵。‎ ‎(3)常用方法 条件 结果 常用方法 应用范围 消毒 较为温和的物理或化学方法 仅杀死物体表面或内部的部分微生物 煮沸消毒法 日常用品 巴氏消毒法 不耐高温的液体 化学药剂 消毒法 用酒精擦拭双手，‎ 用氯气消毒水源 灭菌 强烈的理化因素 杀死物体内外所有的微生物，包括 芽孢和孢子 灼烧灭菌法 接种工具 干热灭菌法 玻璃器皿、‎ 金属用具 高压蒸汽灭菌法 培养基及容器 ‎3.大肠杆菌的纯化培养 ‎(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基 →→→→ ‎(2)目的：在培养基上形成由单个细胞繁殖而来的子细胞群体——菌落。‎ ‎(3)纯化培养方法 主要方法 平板划线法 稀释涂布平板法 纯化原理 通过接种环在琼脂固体培养基的表面连续划线操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面 将菌液进行一系列的梯度稀释，稀释度足够高时，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞 主要步骤 平板划线操作 系列稀释操作和涂布平板操作 接种工具 接种环 涂布器 平板示 意图 ‎(4)菌种的保存方法 ‎①对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。‎ ‎②对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。‎ ‎1.根据功能可分为选择培养基和鉴别培养基。‎ 类型 实例 选择 培养基 培养基中加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌 培养基中加入高浓度的食盐用于分离得到金黄色葡萄球菌 以尿素作为唯一氮源的培养基用于分离分解尿素的细菌 不添加氮源的培养基用于分离固氮微生物 石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除石油污染的微生物的目的 培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物 鉴别培养基 伊红—美蓝培养基可以鉴别大肠杆菌(菌落呈深紫色并带金属光泽)‎ ‎2.平板划线操作中灼烧接种环的目的 灼烧时间 灼烧目的 第一次划线前 杀死接种环上原有的微生物，防止外来杂菌污染培养基 第二次及以后每次划线前 杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端 最后一次划线后 杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者 ‎3.培养基的配制原则 ‎(1)目的要明确：配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。‎ ‎(2)营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。‎ ‎(3)pH要适宜：细菌为6.5～7.5，放线菌为7.5～8.5，真菌为5.0～6.0，培养不同微生物所需的pH不同。‎ ‎4.微生物对主要营养物质的需求特点 ‎(1)自养型微生物所需的主要营养物质是无机盐，碳源可来自大气中的CO2，氮源可由含氮无机盐提供。‎ ‎(2)异养型微生物所需的营养物质主要是有机物，即碳源必须由含碳有机物提供，氮源也主要是由有机物提供，部分异养型微生物也可以利用无机氮源。‎ ‎(1)(人教版选修一P16“旁栏思考题”拓展)请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。‎ ‎①培养细菌用的培养基与培养皿 ‎②玻棒、试管、烧瓶和吸管 ‎③实验操作者的双手 提示　①、②需要灭菌；③需要消毒。‎ ‎(2)(人教版选修一P19图示拓展)平板冷凝后，为什么要将平板倒置？‎ 提示　平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。‎ ‎(3)(人教版选修一P18“旁栏小资料”)微生物接种方法除了平板划线法和稀释涂布平板法之外，还有斜面接种、穿刺接种等方法。这些方法的核心都是防止杂菌污染，保证培养物的纯度。‎ ‎1.(2018·全国卷Ⅱ，37)在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。回答下列问题：‎ ‎(1)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具________(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。‎ ‎(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是________。‎ ‎(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能________。在照射前，适量喷洒________，可强化消毒效果。‎ ‎(4)水厂供应的自来水通常是经过________(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。‎ ‎(5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是________________。‎ 解析　(1)在实验室中，能耐高温的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿和金属材质的实验器具等可以放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。(‎ ‎2)巴氏消毒法或高温瞬时消毒法与煮沸消毒法相比，其优点表现为在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少。(3)紫外线照射能消毒的原因是其能够破坏微生物细胞中的DNA分子。在利用紫外线照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可强化消毒效果。(4)自来水通常采用氯气消毒。(5)采用高压蒸汽灭菌时，若压力达到设定要求，而温度未达到相应要求，最可能的原因是没有排尽高压蒸汽灭菌锅内的冷空气。‎ 答案　(1)可以　(2)在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少　(3)破坏DNA结构　消毒液　(4)氯气　(5)未将锅内冷空气排尽 ‎2.(2018·11月浙江选考节选)回答与微生物培养及应用有关的问题：‎ ‎(1)对培养基进行高压蒸汽灭菌时，灭菌时间应从________________________时开始计时。对于不耐热的液体培养基，一般可将其转入G6玻璃砂漏斗中，采用________方式可较快地进行过滤灭菌。‎ ‎(2)与酿造果醋相比，利用大米、高粱等富含淀粉的原料制醋，需增加________的过程。某醋酸菌培养基由蛋白胨、酵母提取物和甘露醇组成，其中甘露醇的主要作用是________。‎ 解析　(1)由于高压蒸汽灭菌锅的升温升压需要一定时间，而未达设定温度和压力将导致灭菌不彻底，因此对培养基进行高压蒸汽灭菌时，灭菌时间应从达到设定的温度或压力值时开始计时。对于不耐热的液体培养基，如尿素培养基，一般可将其转入G6玻璃砂漏斗中过滤灭菌，采用抽滤方式可加快过滤速度。(2)相比果醋制作中先利用葡萄糖进行酒精发酵，再进行醋酸发酵，以淀粉为原料制醋，需增加淀粉分解成糖的过程。醋化醋杆菌培养基由蛋白胨、酵母提取物和甘露醇组成，其中甘露醇的主要作用是作为碳源。‎ 答案　(1)达到设定的温度或压力值　抽滤 ‎(2)将淀粉分解成糖　作为碳源 走出微生物培养的4个误区 ‎(1)不是所有微生物培养基中均需加入特殊营养物质。碳源、氮源、水分、无机盐是微生物生长必需的四大营养　　　‎ 成分，有些微生物可自行合成特殊营养物质，而对那些合成能力有限或不能合成特殊营养物质的微生物(如乳酸菌)，则需在培养基中添加诸如维生素等物质。‎ ‎(2)稀释涂布平板法统计样品中菌落的数目往往比实际数目“低”。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。而显微计数法由于不能区分死菌与活菌，故所得数值可能比实际值“偏高”。‎ ‎(3)平板划线法只适用于微生物的提纯，不适用于微生物的计数，并且在最后一次划线的末端处的菌种最纯。‎ ‎(4)倒平板的温度一般在50 ℃左右适宜，温度过高会烫手，温度过低培养基又会凝固。平板冷却凝固后需倒置，这样既可使培养基表面的水分更好地挥发，又防止皿盖上的水珠落入培养基，造成培养基污染。‎ 考点二　微生物的筛选和计数 ‎1.微生物分离的原理与措施 ‎(1)原理：自然环境中的微生物是混杂在一起的，因此分离获得纯培养物应首先采用的方法是将单个的细胞与其他细胞分离，再给细胞提供合适的营养和条件，使其生长成为可见的群体。‎ ‎(2)常用措施 ‎①接种过程中尽量使细胞分散开来，如平板划线法、稀释涂布平板法。‎ ‎②运用选择培养基的作用特点，在培养基中添加某种特定的物质，抑制不需要的微生物的生长，促进所需微生物的生长。‎ ‎2.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 ‎(1)筛选菌株的原理 在选择培养基的配方中，把尿素作为培养基中的唯一氮源，原则上只有能够利用尿素的微生物才能够生长。‎ ‎(2)统计菌落数目的方法：一般用稀释涂布平板法。‎ 具体操作如下。‎ ‎①设置重复组，增强实验的说服力与准确性。将待测样品经一系列10倍稀释，选择三个稀释度的菌液，分别取0.1 mL接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布于整个平板表面，放在适宜的温度下培养，计算菌落数。为使结果接近真实值，可将同一稀释度的样液加到三个或三个以上的平板上，经涂布、培养，计算出菌落平均数。‎ ‎②为了保证结果准确，一般选择菌落数为30～300个的平板进行计数，若设置的重复组中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。‎ ‎③计算公式：每克样品中的细菌数＝(C/V)×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。‎ ‎[提醒]‎ 此种方法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。‎ ‎(3)实验流程：‎ 土壤取样→配制土壤溶液和制备培养基→系列稀释→涂布平板与培养→菌落计数 选择培养基四种常见制备方法或实例 ‎1.(2015·江苏卷，19)做“微生物的分离与培养”实验时，下列叙述正确的是(　　)‎ A.高压灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖 B.倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上 C.为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落 D.用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上 解析　本题考查微生物的分离与培养的相关知识。高压灭菌加热结束时，需先切断电源，让灭菌锅内温度降至100 °C以下，压力表的指针回到零时，再打开锅盖，A错误；倒平板时，不应将培养皿盖完全打开，以防污染，B错误；接种环经火焰灭菌后需待冷却后挑取菌落，C错误。‎ 答案　D ‎2.(2018·全国卷Ⅰ，37)[生物——选修1：生物技术实践]‎ 将马铃薯去皮切块，加水煮沸一定时间，过滤得到马铃薯浸出液。在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂，用水定容后灭菌，得到M培养基。‎ 回答下列问题：‎ ‎(1)M培养基若用于真菌的筛选，则培养基中应加入链霉素以抑制________的生长，加入了链霉素的培养基属于________培养基。‎ ‎(2)M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型除氮源外还有________(答出两点即可)。氮源进入细胞后，可参与合成的生物大分子有________(答出两点即可)。‎ ‎(3)若在M培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养，平板上长出菌落后可通过加入显色剂筛选出能产淀粉酶的微生物。加入的显色剂是________，该方法能筛选出产淀粉酶微生物的原理是______________________________________‎ ‎_____________________________________________________________________。‎ ‎(4)甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同一稀释倍数下得到以下结果：‎ 甲同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是110、140和149，取平均值133；乙同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是27、169和176，取平均值124。有人认为这两位同学的结果中，乙同学的结果可信度低，其原因是______________‎ ‎_____________________________________________________________________。‎ 解析　(1)在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。若M培养基是用于真菌的筛选，则应加入链霉素以抑制细菌的生长，其属于选择培养基。(‎ ‎2)马铃薯浸出液中含有淀粉、蛋白质、脂质、无机盐、水等多种物质，因此，除氮源外其中还有微生物生长所需要的碳源、无机盐 等营养要素。进入细胞的氮源可参与合成蛋白质、核酸(DNA、RNA)等含氮的生物大分子。(3)加入显色剂碘液后，淀粉遇碘变蓝，而淀粉的水解产物则不发生这种反应。若在M培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养，土壤中能产生淀粉酶的微生物可将淀粉分解，菌落周围就会出现透明圈，这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选能产淀粉酶的微生物了。(4)乙同学的结果中，1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，结果的重复性太差，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。‎ 答案　(1)细菌　选择 ‎(2)碳源、无机盐　蛋白质、核酸 ‎(3)碘液　淀粉遇碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈 ‎(4)乙同学的结果中，1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差 ‎3.(2019·华大新高考联盟联考)如图是对细菌种类进行鉴别的一种装置。实验时先向小试管中注满pH＝6.8的液体培养基，再把小试管倒置放入含相同液体培养基的大试管中。培养基中含溴甲酚紫，该指示剂在pH 6.8以上呈紫色，pH 5.2以下呈黄色。甲、乙、丙三种细菌可利用的糖类和分解糖类的产物见下表。‎ 细菌种类 可利用的糖类 产生有机酸 产生气体 甲 葡萄糖、乳糖 ‎＋‎ ‎＋‎ 乙 葡萄糖 ‎＋‎ ‎－‎ 丙 葡萄糖 ‎＋‎ ‎＋‎ 注：＋代表能产生；－代表不能产生。‎ 分析回答下列问题：‎ ‎(1)用接种环挑取菌种，接种到培养基中。接种环在使用________(填“前”、“后”或“前和后”)应用________法灭菌。‎ ‎(2)现有两种培养基，培养基A以乳糖为唯一碳源，培养基B以葡萄糖为唯一碳源，若要鉴别出甲、乙、丙三种细菌，应选用培养基________。若出现________________________________现象，则为细菌甲。‎ ‎(3)为确定实验过程中是否存在杂菌污染，本实验还应设置一组对照，对照组的操作应为_______________________________________________________________。‎ 答案　(1)前和后　灼烧 ‎(2)A和B　培养基A(或A和B)变为黄色，小试管中有气泡 ‎(3)将未接种的培养基在相同条件下放置适宜的时间，观察培养基是否变浑浊 澄清易错易混·强化科学思维 ‎[易错易混]‎ 易错点1　混淆两种“对照组”与“重复组”‎ 点拨　(1)两种对照组作用比较 ‎①判断培养基中“是否有杂菌污染”，需将未接种的培养基同时进行培养。‎ ‎②判断选择培养基“是否具有筛选作用”，需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上菌落数目，进行对比得出结论。‎ ‎(2)重复组的设置及作用 为排除偶然因素对实验结果的干扰，在每一稀释度下宜设置3个平板作重复组，选择菌落数均在30～300且数目相差不大的三个平板，用“平均值”代入计数公式予以计算菌落数。‎ 易错点2　不清楚为什么测定活菌的数量不能用平板划线法？‎ 点拨　由于在所划的线中，一般只有最后一次划线的末端才会形成只由一个细菌形成的菌落，而其他一些菌落往往由两个细菌或多个细菌繁殖而成，而在计数时一个菌落对应着一个细菌，这样在划线所得的平板中，菌落数目远低于活菌的实际数值，所以不能用平板划线法测定活菌数量。‎ ‎[深度纠错]‎ 某研究小组对生活用水中大肠杆菌含量进行检测，并研究在高盐度(NaCl)工业废水中提取可降解有机物的耐盐菌，请分析回答有关问题：‎ ‎(1)大肠杆菌进行检测的操作和配方图如下：‎ 若要将图乙中大肠杆菌检测配方修改后用于培养可降解高盐度工业废水中有机物的耐盐菌，则应去除的成分有________________，同时需要添加的成分是________________。‎ ‎(2)将高盐度工业废水采用平板划线法接种在含3%NaCl的固体培养基上(如图一)。然后置于适宜条件下培养一段时间，观察形成的菌落特征；再将分离纯化后的菌株制成菌液，取等量菌液，分别加入到不同NaCl浓度的液体培养基中摇床培养35小时，定时取样统计活菌数目，测定结果(如图二)。‎ 图一所示操作，第一次划线前灼烧接种环的目的是____________，第二次及之后的几次划线前灼烧接种环的目的是_______________________________________。‎ 图二所示活菌数目在进行统计时，直接从静置的培养液中取样计数的做法是错误的，正确的操作是将培养液________后取样计数，且每种浓度需设3个重复实验求其平均值。‎ ‎(3)由图二可知，该耐盐菌最适合处理含________(填浓度)NaCl的工业废水，原因是___________________________________________________________________。‎ 解析　(1)图乙中伊红、美蓝是用来鉴别大肠杆菌的，因此若用于培养可降解高盐度工业废水中有机物的耐盐菌，需去除其中的伊红、美蓝，此外由于工业废水中的有机物能够作为碳源，还应去除乳糖这一碳源；作为选择培养基，同时需加入高浓度的氯化钠溶液。(‎ ‎2)第一次接种前灼烧接种环的目的是防止杂菌污染。接种后接种环上有残留的菌种，因此第二次及之后的几次划线前灼烧接种环的目的是杀死上次划线后接种环上残留的菌种。取样计数时，需将培养液振荡摇匀，使菌种分布均匀，再吸取培养液。(3)分析图二可知，处理后每隔5小时取样检测时，3种NaCl浓度下，均是NaCl浓度为3%时该耐盐菌的相对数量最多，这说明该耐盐菌适合处理NaCl浓度为3%的工业废水。‎ 答案　(1)伊红、美蓝、乳糖　(高浓度)氯化钠　(2)防止杂菌污染　杀死上次划线后接种环上残留的菌种(使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端)　振荡摇匀　(3)3%　据图可知，在3种NaCl浓度下，NaCl浓度为3%时该菌的相对数量最多 随堂·真题&预测 ‎1.(2016·江苏卷，改编)漆酶属于木质降解酶类，在环境修复、农业生产等领域有着广泛用途。下图是分离、纯化和保存漆酶菌株的过程，相关叙述错误的是(　　)‎ A.生活污水中含有大量微生物，是分离产漆酶菌株的首选样品 B.筛选培养基中需要加入漆酶的底物，通过菌落特征挑出产漆酶的菌落 C.在涂布平板上长出的菌落，在通过划线进一步纯化 D.斜面培养基中含有大量营养物，可在低温下长期保存菌株 解析　漆酶降解“木质”，则漆酶菌株多存在于“木质”丰富的场所，虽然生活污水中含有大量微生物，但不一定含有产漆酶的菌株，A错误；筛选产漆酶微生物的培养基中应加入木质素等漆酶降解的底物，可依据不同菌种形成的菌落的不同特点，挑选出产漆酶的菌落，B正确；在涂布平板上长出的菌落，再通过划线进一步纯化，C正确；斜面培养基中含有大量营养物，可在低温下长期保存菌株，D正确。‎ 答案　A ‎2.(2018·全国卷Ⅲ，37)[生物——选修1：生物技术实践]‎ 回答下列与酵母菌有关的问题：‎ ‎(1)分离培养酵母菌通常使用________(填“牛肉膏蛋白胨”“MS”或“麦芽汁琼脂”)培养基，该培养基应采用________灭菌法灭菌。若将酵母菌划线接种在平板上，培养一段时间后可观察到菌落，菌落的含义是___________________________‎ ‎_____________________________________________________________________。‎ ‎(2)酵母菌液体培养时，若通入氧气，可促进________(填“菌体快速增殖”“乙醇产生”或“乳酸产生”)；若进行厌氧培养，可促进________(填“菌体快速增殖”“乙醇产生”或“乳酸产生”)。‎ ‎(3)制作面包时，为使面包松软通常要在面粉中添加一定量的酵母菌，酵母菌引起面包松软的原因是_____________________________________________________。‎ 解析　(1)酵母菌为异养型生物，通常使用麦芽汁琼脂培养基培养；培养基常用高压蒸汽灭菌法灭菌；由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体称为菌落。‎ ‎(2)酵母菌为兼性厌氧型生物，有氧条件利于其繁殖，无氧条件下其进行酒精发酵。(3)酵母菌分解葡萄糖可产生二氧化碳，使面包松软多孔。‎ 答案　(1)麦芽汁琼脂　高压蒸汽　由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体　(2)菌体快速增殖　乙醇产生 ‎(3)酵母菌分解葡萄糖会产生CO2，CO2使面包松软 ‎3.(2020·高考预测)石油烃是石油管道泄漏的主要污染物。为了筛选出分解石油烃能力较强的微生物，进行了如下系列操作。请回答问题：‎ ‎(1)分解石油烃的微生物一般从土壤中分离，获取土壤样品的取样地点最好选在________。‎ ‎(2)图1表示获取土壤样品后的研究过程。‎ 为了能有效地分离出分解石油烃的微生物，①～③号瓶所用的液体培养基的成分共有的特点是________，从而有利于分解石油烃的微生物的生长。‎ ‎(3)可采用图2中平板乙所示的________(方法)检测图1的③号瓶中分解石油烃的微生物数量。在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间，这样做的目的是___________________________________________________________；‎ 然后，将图1③号瓶中的1 mL菌液稀释100倍，在3个平板上用该方法分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每毫升该菌液中的活菌数为________个。‎ 图2‎ ‎(4)Ⅰ.若实验室采用图3中的操作分离纯化优良菌种，首次接种最合理的排序是________。‎ 图3‎ Ⅱ.下列有关操作正确的是________(填字母)。‎ A.划线分离时，需要把接种环深入到培养基中进行接种 B.划线时要将最后一区域的划线与第一区域的划线相连 C.超净工作台在使用前，可用紫外线灯杀菌 答案　(1)被石油污染处 ‎(2)以石油烃为唯一碳源 ‎(3)稀释涂布平板法　检测培养基灭菌是否合格　3.8×104‎ ‎(4)Ⅰ.②①④①③②　Ⅱ.C