【生物】2019届一轮复习人教版微生物的筛选、分离与计数学案

【生物】2019届一轮复习人教版微生物的筛选、分离与计数学案

从近五年全国卷高考看，《生物技术实践》专题的命题绝大多数立足于微生物培养、应用、分离、计数等。答题过程中须明确所有操作都要围绕着“目的”进行：‎ ‎（1）如果实验目的是分离某种特定的目标微生物；关键点在于如何依据该微生物某方面特点制备特定选择培养基；‎ ‎（2）如果是测定细菌的数量，则必须明确可能会引发数量变化误差的操作（稀释时的倍数、接种过程的无菌操作）备考时务必强化“选择”与“鉴定”的界定及实验方案制定，同时必须熟练把握计数方法及公式套用等。‎ ‎【例证】 （2014·全国卷Ⅰ）植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。回答下列问题。‎ ‎（1）分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分组成的复合酶，其中的葡萄糖苷酶可将　　　　分解成　　　　。‎ ‎（2）在含纤维素的培养基中加入刚果红（CR）时，CR可与纤维素形成　　　　色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的　　　　。‎ ‎（3）为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基（成分见下表）：‎ 酵母膏 无机盐 淀粉 纤维素粉 琼脂 CR溶液 水 培养基甲 ‎＋‎ ‎＋‎ ‎＋‎ ‎＋‎ ‎－‎ ‎＋‎ ‎＋‎ 培养基乙 ‎＋‎ ‎＋‎ ‎＋‎ ‎－‎ ‎＋‎ ‎＋‎ ‎＋‎ 注：“＋”表示有，“－”表示无。‎ 据表判断，培养基甲　　　　（填“能”或“不能”‎ ‎）用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是　　　　　　　　　　；培养基乙　　　　（填“能”或“不能”）用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是_____________________________。‎ 解析　（1）纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，如下图：‎ ‎（2）刚果红可与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物无法形成，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过观察是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。‎ ‎（3）分离和鉴别纤维素分解菌的培养基为固体培养基，且需以纤维素为唯一碳源。‎ 答案　（1）纤维二糖　葡萄糖　（2）红　透明圈 ‎（3）不能　液体培养基不能用于分离单菌落　不能　培养基中没有纤维素，不会形成CR—纤维素红色复合物，即使出现单菌落也不能确定其为纤维素分解菌 ‎1.分离微生物的原理与措施 ‎（1）原理：自然环境中的微生物是混杂在一起的，因此分离获得纯培养物应首先采用的方法是将单个的细胞与其他细胞分离，再给细胞提供合适的营养和条件，使其生长成为可见的群体。‎ ‎（2）常用措施 ‎①接种过程中尽量使细胞分散开来，如平板划线法、稀释涂布平板法。‎ ‎②运用选择培养基的作用特点，在培养基中添加某种特定的物质，抑制不需要的微生物的生长，促进所需微生物的生长。‎ ‎2.选择培养基四种常见制备方法或实例 下面是筛选抗链霉素大肠杆菌的实验步骤及相关图解。‎ 实验步骤：‎ ‎①把大量对链霉素敏感的大肠杆菌接种在不含链霉素的培养基1的表面，进行培养。‎ ‎②待其长出密集的小菌落后，用影印法接种到不含链霉素的培养基2上，随即再影印到含有链霉素的培养基3上，进行培养。‎ ‎③在培养基3上出现了个别抗链霉素的菌落，将其挑选出。‎ 请回答：‎ ‎（1）配制培养基时除了满足基本的营养条件外，还需满足微生物生长对特殊营养物质、　　　　、　　　　的要求。‎ ‎（2）从功能上看，含有链霉素的培养基属于　　　　培养基。若在培养基中加入伊红和美蓝，则培养皿中长出的菌落颜色为　　　　。由图可知，1号培养基接种的方法为_________________________________________。‎ ‎（3）对2和3进行比较，在2上找到与3上相应的菌落，挑取其中一个菌落接种到　　　　（填“含链霉素”或“不含链霉素”）的培养基上，如果有较多的菌落出现，则说明该抗性基因突变发生在该菌接触链霉素之　　　　（填“前”或“后”）。‎ ‎（4）3中的菌落比1、2中的菌落少很多，这说明了基因突变具有　　　　的特点。‎ 解析　（1）配制培养基时在提供几种基本营养条件的基础上，还需满足微 生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。（2）链霉素是抗生素，对大肠杆菌具有选择作用。在伊红和美蓝培养基上.大肠杆菌菌落颜色为黑色。由题图可知，1号培养基接种的方法为稀释涂布平板法。（3）培养基2和培养基3上相同的菌落，是具有相同性状的大肠杆菌形成的，将培养基2中一个相应菌落接种到含链霉素的培养基上，若出现较多的菌落，则说明该抗性基因突变发生在该菌接触链霉素之前。（4）抗链霉素性状是大肠杆菌基因突变后获得的性状.3号培养皿中的菌落比1号、2号中的菌落少很多，这说明了基因突变频率很低。‎ 答案　（1）pH　氧气 ‎（2）选择　黑色　稀释涂布平板法 ‎（3）含链霉素　前 ‎（4）频率低/低频性 影印法接种的具体过程是：将待测的浓缩菌悬液涂在合适的平板上，等其长好后作为母平板（每个平板上的菌落控制在30～300个）；用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板略小的圆柱形木块上，构成印章（即接种工具）；然后把长有菌落的母平板倒置在丝绒的印章上，轻轻印一下；再把此印章在另一含有选择培养基的平板上轻轻印一下，经培养后，选择培养基平板上长出的菌落与母平板上的菌落位置对应，比较影印平板与母平板上菌落生长情况，即可从相应位置的母平板上选出待测的突变型菌落。影印法最初是为证明微生物的抗药性突变是自发的、与相应的环境因素无关而设计的接种方法，目前已广泛应用于营养缺陷型微生物的筛选以及抗药性菌株筛选等研究工作中。　　　‎ ‎【例证】 （2014·全国卷Ⅱ，39）为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问题：‎ ‎（1）该小组采用稀释涂布平板法检测水样中细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是 ‎___________________________________________________________________；‎ 然后，将1 mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为　　　　　　　　。‎ ‎（2）该小组采用平板划线法分离水样中的细菌，操作时，接种环通过　　　　‎ 灭菌。在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线。这样做的目的是________________________________________________。‎ ‎（3）示意图A和B中，　　　　表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。‎ ‎（4）该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液中　　　　的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高　　　　的利用率。‎ 解析　（1）在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间，检测培养基平板灭菌是否合格；每升水样中的活菌数为：（39＋38＋37）/3＝38，再除以0.1乘以100，得到1毫升中的菌数，再乘以1000就是1升中的菌数，故为3.8×107。‎ ‎（2）用平板划线法应先将接种环灼烧灭菌再划线。第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，达到稀释的目的，使得最后能够得到单个菌落。‎ ‎（3）根据图示可知，B为稀释涂布平板法接种后培养得到的菌落。‎ ‎（4）振荡的作用相当于搅拌，可以提高培养液中溶解氧的含量，还可以使菌体与培养液充分接触，提高了营养物质的利用率，因此振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。‎ 答案　（1）检测培养基平板灭菌是否合格　3.8×107‎ ‎（2）灼烧　将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落 ‎（3）B　（4）溶解氧　营养物质 微生物计数的方法专项归纳 ‎1.间接计数法（也叫活菌计数法）‎ 常用的是稀释涂布平板法。‎ ‎（1）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少个活菌。‎ ‎（2）操作：①设置重复组，增强实验的说服力与准确性。将待测样品经一系列10倍稀释，选择三个稀释度的菌液，分别取0.1 mL接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布于整个平板表面，放在适宜的温度下培养，计算菌落数。为使结果接近真实值，可将同一稀释度的样液加到三个或三个以上的平板上，经涂布、培养，计算出菌落平均数。‎ ‎②为了保证结果准确，一般选择菌落数为30～300个的平板进行计数，若设置的重复组中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。‎ ‎③计算公式：每克样品中的细菌数＝（C/V）×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），M代表稀释倍数。‎ ‎[提醒]‎ 此种方法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。‎ ‎2.显微镜直接计数法 ‎（1）原理：利用特定细菌计数板或血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量，但不能区分细菌的死活。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定面积（1 mm2）和高（0.1 mm）的计数室，在1 mm2的面积里又被划分成25个（或16个）中格，每个中格进一步划分成16个（或25个）小格，但计数室都是由400个小格组成的。‎ ‎（2）操作：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再将稀释的样品滴在计数板上，稍等片刻，待细菌全部沉降到计数室底部再在显微镜下统计4～5个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按公式求出每毫升样品中所含的细菌数。‎ ‎（3）计算公式：每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10 000×稀释倍数。 ‎ ‎3.滤膜法 以测定饮用水中大肠杆菌的数目为例，将已知体积的水过滤后，将滤膜放于伊红—美蓝培养基上培养，在该培养基上，大肠杆菌的菌落呈现黑色，可根据培养基上黑色菌落的数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。‎ ‎（2017·吉林松原模拟）研究人员用有机化合物X、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基成功地从土壤中筛选出能高效降解有机化合物X的细菌（目的菌）。下图是从土壤中筛选出该细菌的过程示意图，下表是分离纯化的结果。请回答下列问题：‎ 记录项目：透明圈直径/菌落直径 菌落编号 ‎1‎ ‎2‎ ‎3‎ ‎48小时 ‎1.6‎ ‎2.8‎ ‎3.0‎ ‎72小时 ‎2.2‎ ‎1.2‎ ‎5.0‎ ‎96小时 ‎2.3‎ ‎1.2‎ ‎4.2‎ ‎（1）培养基中的有机化合物X主要为目的菌提供　　　　等营养要素。从土壤中富集能有效降解有机化合物X的细菌时，应选用　　　　（填“固体”或“液体”）培养基。‎ ‎（2）配制成10倍稀释液时，用无菌移液管从富集液中吸取1 mL，移入盛有 ‎　　　　mL无菌水的试管中，并依次配制102～1010的梯度稀释液。‎ ‎（3）在分离、纯化过程中，图中②③过程接种的方法分别为　　　　、　　　　。在倒平板前，应对玻璃器皿和培养基灭菌，灭菌方法是　　　　。‎ ‎（4）分析菌种的分离纯化结果，应选择　　　　号菌落进行扩大生产，原因是 ‎___________________________________________________________________。‎ 解析　（1）筛选微生物用选择培养基，培养基中的有机化合物X主要为目的菌提供碳源、氮源等营养要素，不能降解有机化合物 X的微生物不能生存。从土壤中富集能有效降解有机化合物X的细菌时，应选用液体培养基，有利于富集培养。（2）配制成10倍稀释液时，用无菌移液管从富集液中吸取1 mL，移入盛有9 mL无菌水的试管中，并依次配制102～1010的梯度稀释液。（3）在分离、纯化过程中，微生物接种方法常用稀释涂布平板法、平板划线法。在倒平板前，对玻璃器皿和培养基灭菌的方法是高压蒸汽灭菌法。（4）由于目的菌能有效降解有机化合物X产生透明圈，透明圈直径/菌落直径越大，说明降解有机化合物X的能力越强，因此应选择3号菌落进行扩大生产。‎ 答案　（1）碳源（或碳源、氮源）　液体　（2）9　（3）稀释涂布平板法　平板划线法　高压蒸汽灭菌法　（4）3　透明圈直径/菌落直径越大，降解有机化合物X的能力越强 随堂·真题&预测 ‎1.（2014·四川理综，节选）有机农药苯磺隆是一种除草剂，长期使用会污染环境。研究发现，苯磺隆能被土壤中某些微生物降解。分离降解苯磺隆的菌株和探索其降解机制的实验过程如图甲、乙所示。‎ ‎（1）微生物生长繁殖所需的主要营养物质有碳源、水、　　　　四类，该实验所用的选择培养基只能以苯磺隆作为唯一碳源，其原因是________________________________。‎ ‎（2）与微生物培养基相比，植物组织培养的培养基常需添加生长素和　　　　，这些植物激素一般需要事先单独配制成　　　　保存备用。‎ ‎（3）为探究苯磺隆的降解机制，将该菌种的培养液过滤离心，取上清液做图乙所示实验。该实验的假设是　　　　　　　　　　　　‎ ‎，该实验设计是否合理？为什么？　　　　　　　　　　　　　　　　　　。‎ 解析　（1）微生物生长所需要的主要营养物质包括：碳源、氮源、水和无机盐。使用选择培养基是因为它是允许特定的微生物生长和增殖，同时又能抑制或阻止其他微生物的生长和增殖的培养基，该实验所用培养基只有能利用苯磺隆的微生物才能正常生长和增殖。‎ ‎（2）植物组织培养常需要添加的植物激素有生长素和细胞分裂素，调整二者的比例可以诱导脱分化和再分化。MS培养基的成分一般先分别配制成母液备用。‎ ‎（3）题中实验为将该菌种的培养液过滤后离心，取上清液加入蛋白酶处理后，测得其对苯磺隆的降解率，意为假设目的菌种能产生降解苯磺隆的蛋白质，若用蛋白酶处理后，可使该蛋白质分解，苯磺隆降解率下降，则假设成立。但由于缺乏空白对照，不能比较蛋白酶处理是否降低苯磺隆降解率，该实验不能得出相应结论。‎ 答案　（1）氮源和无机盐　只有能利用苯磺隆的微生物能正常生长和繁殖 ‎（2）细胞分裂素　母液 ‎（3）目的菌株能分泌降解苯磺隆的蛋白质　不合理，缺少空白对照 ‎2.（2019·高考预测）纤维素分解菌能够产生纤维素酶分解纤维素。回答下列问题：‎ ‎（1）在筛选纤维素分解菌的过程中，通常用　　　　染色法，这种方法能够通过颜色反应直接对纤维素分解菌进行筛选。甲同学在实验时得到了如图所示的结果，则纤维素分解菌位于　　　　。‎ A.③ B.①②‎ C.②③ D.①②③‎ ‎（2）乙同学打算从牛胃中分离纤维素分解菌并计数，与分离醋酸菌相比，进行培养时除了营养不同，最主要的实验条件差别是_______________________________。该同学采用活菌计数法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目__________________________________________。‎ ‎（3）丙同学在提取和分离纤维素酶的过程中，为了抵制外界酸和碱对酶活性的影响，采取的措施是向提取液和分离液中添加　　　　。若探究纤维素酶活性的最适温度，如何设置对照？ ________________________________。‎ 解析　（1）刚果红与纤维素形成的红色复合物在纤维素被分解后将不再形成，则在培养基上会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。（2）牛胃是一个厌氧环境，所以其中的纤维素分解菌与需氧的醋酸菌相比培养条件有所不同。因是活菌计数法，所以当两个或多个细菌连在一起时平板上只观察到一个菌落，所以菌落数目比实际的少。（3）探究最适温度可设置一系列的温度梯度进行相互对照，其他无关变量要保持相同且适宜。‎ 答案　（1）刚果红　A　（2）保证无氧环境　少（低）‎ ‎（3）缓冲溶液　设置一系列的温度梯度进行相互对照 ‎（时间：30分钟　满分：100分）‎ ‎1.（2017·河南十所名校联考，23）如图表示研究者从土壤中筛选分解尿素的细菌并计数的相关实验，请据图回答下列问题：‎ ‎（1）进行过程①和②的目的分别是　　　　和　　　　；图中弧线箭头上“？”的具体操作是　　　　。‎ ‎（2）进行培养基配制和灭菌时，灭菌与调节pH的先后顺序是____________________。‎ 倒平板时，待平板冷却凝固后，应将平板倒过来放置，并用记号笔在皿底上标明培养微生物名称、平板上培养样品的稀释度、制作者姓名、培养日期及　　　　等信息。纯化菌种时为了得到单一菌落，常采用的接种方法是　　　　和　　　　。‎ ‎（3）在以尿素为唯一氮源的培养基中加入　　　　。培养后，若出现　　　　色就可以鉴定其中含有能够分解尿素的细菌。‎ ‎（4）研究者可以通过观察培养形成的菌落的　　　　‎ ‎、隆起程度等特征，来判断培养基上是否感染了其他细菌。在实验中，研究者每隔24小时统计一次菌落数目，并选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止 ‎____________________________________________。‎ 解析　（1）根据图示过程可知，①和②的目的分别是选择培养、增加分解尿素细菌的数量。图中弧线箭头上“？”的具体操作是挑出分解尿素细菌的菌落。‎ ‎（2）配制培养基和灭菌时，应该是先调pH，再进行灭菌。培养基的种类、培养日期、平板上培养样品的稀释度、培养微生物名称及制作者姓名等信息要用记号笔在皿底上标明。纯化菌种时为了得到单一菌落，常采用的接种方法是平板划线法和稀释涂布平板法。（3）分解尿素的细菌鉴定时应该加入酚红指示剂，培养过程中pH升高，酚红指示剂会变为红色，原因是细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，使培养基的碱性增强，出现红色说明含有能够分解尿素的细菌。（4）可以根据菌落特征来判断不同的细菌，菌落特征一般体现在形状、大小、颜色和隆起程度。实验中，研究者每隔24小时统计一次菌落数目，并选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足导致遗漏细菌数目。‎ 答案　（1）选择培养　增加分解尿素的细菌的数量　挑出菌落 ‎（2）先调节pH后灭菌　培养基种类　平板划线法　稀释涂布平板法（后两空位置可颠倒）（3）酚红指示剂　红 （4）形状、大小、颜色　因培养时间不足导致遗漏细菌数目 ‎2.（2017·河南十所名校联考，37）微生物的培养在生物科学史和现代生物工程中都是极其重要的基础技术。下图1是某学生重复艾弗里证明DNA是遗传物质实验的其中一组实验；下图2是基因工程中运用影印法将培养基A上的菌落按原来方向印在培养基B上，以检测重组质粒是否导入大肠杆菌的示意图。请据图回答下列相关问题：‎ ‎（1）图1、图2的培养结果显示，两实验中使用的都是　　　　（填物理状态）培养基。‎ ‎（2）在配制图2中的培养基时，除考虑营养、pH、渗透压等条件外，还要考虑在培养基A和B中加入　　　　（填“相同”或“不同”）种类的抗生素。在配制含琼脂的培养基和倒平板的过程中，下列选项不需要的是　　　　（填序号）。‎ ‎①酒精灯　 ②接种环　 ③高压蒸汽灭菌锅　 ④培养皿 ‎（3）培养基灭菌是避免杂菌污染的有效手段之一，适用于图1、图2所示培养基的灭菌方法是_________________________________________________；‎ 接种前还需检测灭菌效果，方法是将　　　　置于恒温箱中，在适宜温度下培养一段时间，观察培养基上是否有菌落产生。‎ ‎（4）实验证明，上述两项实验中R型菌和大肠杆菌的转化率都很低，为获得图1、图2所示的培养结果，一是要设法提高图1中S型菌的　　　　；二是要使用恰当的方法接种。两实验都不能用平板划线法和稀释涂布平板法接种，而应采用不加稀释的涂布平板法接种R型菌和大肠杆菌，理由是___________________________。接种培养4天后，可通过观察　　　　的形态特征来识别R型菌和大肠杆菌。‎ 解析　本题考查微生物的培养与分离的知识，旨在考查考生的理解能力和获取信息的能力。（1）从图1、图2可以看出，两实验中使用的都是固体培养基。‎ ‎（2）要检测重组质粒是否导入大肠杆菌，检测的依据一般是重组质粒的抗性发生了改变，因此在培养基A和培养基B中应加入不同种类的抗生素。在配制含琼脂的培养基和倒平板的过程中，不需要接种环。（3）对培养基灭菌一般采用高压蒸汽灭菌法，接种前需要检测灭菌效果，其方法是进行空白对照，将未接种的培养基置于恒温箱中，在适宜温度下培养一段时间，观察培养基上是否有菌落产生。（4）上述两项实验中R型菌和大肠杆菌的转化率都很低，为获得图1、图2所示的培养结果，一是要提高图1中S型菌的DNA纯度；二是要使用恰当的方法接种，不选用平板划线法和稀释涂布平板法，而采用不加稀释的涂布平板法接种R型菌和大肠杆菌，是因为这两种方法都可能因稀释后菌种数量极少而无法观察到转化成功的菌落。识别不同类型的细菌，一般可通过观察菌落的特征来加以区分。‎ 答案　（1）固体　（2）不同　②　（3）高压蒸汽灭菌法　未接种的培养基　‎ ‎（4）DNA纯度　平板划线法和稀释涂布平板法都可能因稀释后菌种数量极少而无法观察到转化成功的菌落　菌落 ‎3.（2017·开封市三模，37）有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同学欲从受原油污染的土壤中筛选出高效降解原油的菌株。回答问题：‎ ‎（1）在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以　　　　为唯一碳源的固体培养基上，从功能上讲，这种培养基属于　　　　培养基。‎ ‎（2）制备培养基时需采取　　　　方法灭菌，目的是______________________。‎ ‎（3）纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有两种，下面两图是两种接种方法接种后培养的效果图解。获得图A效果的接种方法是______________________________，‎ 获得图B效果的接种方法是___________________________________。现发现某一培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是____________________________。‎ ‎（4）在进行分离该菌实验时，某同学从培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。该同学的实验结果产生的原因可能有 ‎　　　　（填序号）‎ ‎①由于土样不同　②由于培养基污染　③由于操作失误　④没有设置对照 答案　（1）原油　选择　（2）高压蒸汽灭菌　杀死微生物及芽孢　（3）稀释涂布平板法　平板划线法　菌液浓度过高（或培养过程被杂菌污染，或用接种针划下一区域前接种针没有灭菌导致菌液没有稀释开等）　（4）①②③‎ ‎4.（2017·安阳市二模，37）“口嚼酒”因日本著名动画电影导演新海诚的新作《你的名字》而引起人们的关注。世界上有些地方很早就有口嚼酒的记载。请回答下列相关问题：‎ ‎（1）口嚼酒的做法是：首先需要将米煮熟，然后放入口中咀嚼一段时间，直至米粒变为糊状，再将其吐入特制容器中，令其发酵，经过几天便成为甜酸味的酒。上述的制作过程中，“咀嚼”可能具有两个作用，分别是 ‎ ‎　　　　　　　　　　　　和　　　　　　　　　　　　‎ ‎。参与口嚼酒形成初期的微生物主要是来自空气中的　　　　，末期形成酸味，可能是因为密封不严，产生了　　　　等物质。‎ ‎（2）口嚼酒是一种自酿酒，不仅品质不高，而且卫生条件难以把握，会有杂菌滋生的危险。某生物兴趣小组想探究口嚼酒制作过程中会滋生哪些微生物，进行了进一步的实验，实验步骤如下：‎ ‎①制作口嚼酒。‎ ‎②制作培养基：计算→称量→溶化→　　　　→倒平板。‎ ‎③接种：每天同一时间将口嚼酒液体摇匀后按照图1和图2的方法进行操作，该方法是　　　　。并在每天接种的培养皿上注明培养日期，最后将所有培养基放在相同且适宜的环境下培养。‎ ‎④经过一段适宜的时间后，观察不同培养基上的菌落数和菌落的形态，并进行品种鉴定。图3是三个不同时间获得的培养基，其时间先后为　　　　（填字母）。‎ 上述实验在时间上形成前后对照，但是还需要设置一个空白对照，目的是_______________________________________________________。‎ ‎（3）兴趣小组成员在实验后期看到培养基上长满了许多杂菌菌落，若他们采用图4的方法对杂菌中的目的菌进行纯化，则在　　　　（填数字）区最可能获得纯净的目的菌。‎ 答案　（1）增大酶与米饭的接触面积，有利于发酵　使唾液淀粉酶将米饭中的淀粉分解成麦芽糖　酵母菌　醋酸　（2）②灭菌（或高压蒸汽灭菌）　③稀释涂布平板法　④B、C、A　检验培养基灭菌是否合格　（3）5‎